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从生物标记物发现到功能验证,非靶向代谢组学及其拓展研究

来源:安捷伦科技 阅读数:144 时间:2020-07-17 11:45:13

非靶向代谢组学是生物标志物发现的重要手段,如何以非靶向代谢组学研究为始,聚焦机制阐明为终,是当前代谢组学进入新的发展阶段必须要思考和回答的问题。

本期我们特别分享来自中国科学院大连化学物理研究所许国旺研究员和刘扬研究员发表在 Clinical Cancer Research 上的一篇肝癌非靶向代谢组学文章[1],文章介绍了非靶向代谢组学及其导向的拓展研究策略如何在临床疾病研究中发挥重要作用。

专家解读

代谢重编程是肿瘤细胞的重要特征之一。极性代谢物在肿瘤生成与抑制方面发挥着关键调控作用。基于毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)的非靶向代谢组学方法可实现对极性代谢组的高效分析,有助于发现新型的功能代谢物,对后续临床具有重要意义。

肿瘤的代谢过程非常复杂,且存在个体差异,全面揭示肿瘤相关的代谢紊乱机制,需要从三个环节着手展开研究:

  • 首先,需要依托非靶向筛查和靶向验证相结合的分析技术对功能代谢物进行筛选

  • 其次,需要对功能代谢物在肿瘤内环境下的动态代谢过程进行研究

  • 最后,在体内动物模型和/或体外细胞模型基础上对其生物功能进行验证

本研究是采用功能代谢组学技术研究疾病相关代谢重编程机制的一个典型范例,具有广泛的借鉴意义。

研究背景及目标

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是临床最常见的一种肝恶性肿瘤,具有很高的发病率和死亡率。肿瘤细胞常常通过代谢重编程来促进存活、快速增殖及转移等,然而肝细胞癌的代谢重编程机制仍不明确。

本研究旨在通过非靶向代谢组学及其导向的拓展研究揭示肝细胞癌在缺氧微环境下的代谢重编程分子机制。

实验设计

1) 基于毛细管电泳-飞行时间质谱联用系统(CE/TOF MS)开展非靶向代谢组学分析,寻找潜在生物标志物及探究扰动的代谢通路

2)非靶向代谢组学的关键发现通过靶向代谢组学来验证,代谢流分析结合生物学实验进一步阐释机制

3)采用羟脯氨酸代谢机制探索肝癌耐药性

图 1. CE/TOF MS

研究结果

1)非靶向代谢组学揭示肝癌组织中羟脯氨酸显著增加

采用 Agilent CE/TOF MS 对 69 例肝脏组织样品进行了代谢轮廓分析,包括 23例正常组织-Normal、18例边界组织-Borderline,28例癌组织-Carcinoma.

图 2. 肝组织代谢轮廓分析结果 A:PLS-DA得分图;B:显著差异代谢物的文氏图;C:通路富集结果

PLS-DA 分析结果揭示肝癌组织样品组与正常组及边界组聚类明确,非靶向代谢组学研究一共发现并鉴定了68个显著变化的代谢物,扰动的通路主要集中在糖代谢、甘油磷脂代谢及氨基酸代谢途径。

进一步分析发现HCC肿瘤组织中脯氨酸代谢变化尤其显著,表现为脯氨酸消耗加快,羟脯氨酸积累增多,其体内水平与肝癌恶性程度呈正相关。

2)羟脯氨酸分子生物学及功能验证

基于非靶向代谢组学的结果,进一步通过靶向代谢组学、13C代谢流分析及免疫组化、Western blotting等生物学验证,同时关联临床指征,探究了羟脯氨酸的生物学功能:

  • 在缺氧条件下脯氨酸合成与分解代谢明显加快,并促进了肝癌细胞的存活

  • 羟脯氨酸在缺氧微环境中通过抑制缺氧诱导因子(HIF1α)的羟基化来增强其蛋白的稳定性,从而促进肝癌细胞的生存

  • 缺氧上调了脯氨酸合成通路上的关键酶-P5CS的表达,抑制了分解羟脯氨酸的关键酶-PRODH2的活性,导致羟脯氨酸的累积

  • 体内和体外阻断脯氨酸合成可以有效地诱导肝癌细胞凋亡并抑制肿瘤生长

3)羟脯氨酸代谢机制研究索拉非尼(sorafenib)耐药性

索拉非尼是被 FDA 批准的可用于肝癌治疗的一线靶向药物,但大多数患者表现出原发性或获得性耐药。研究表明,肝癌组织所处的缺氧微环境与耐药性密切相关,但该过程的分子机制尚不清楚。

本研究基于羟脯氨酸在肝癌代谢中的重要作用,进一步在细胞水平上探究了羟脯氨酸与索拉非尼(sorafenib)耐药机制的关联。基于构建的模型,推测了索拉非尼肝癌耐药机制与羟脯氨酸在缺氧微环境中抑制了 HIF1α 的羟化反应相关。

图 3. 谷氨酰胺、脯氨酸和羟脯氨酸代谢轴支持HIF依赖缺氧反应的作用模型


结论

CE/TOF MS 将毛细管电泳的快速分析、高效分离与飞行时间质谱提供的精确质量数和结构信息结合起来,是复杂样品极性代谢物分析的有效手段。本研究基于 CE/TOF MS 非靶向代谢组学及其导向的机制拓展研究,发现脯氨酸与羟脯氨酸代谢途径与肝癌细胞在缺氧微环境下发生代谢重编程进行缺氧应答及生存增值密切相关。研究成果对洞察肝癌发病及耐药性研究提供了重要的科学参考,也为利用靶向脯氨酸生物合成通路来治疗肝癌的可能性提供了基础理论支持。同时,所采用的非靶向代谢组学及其拓展研究策略,也将为肿瘤及其它临床疾病研究,提供从生物标记物发现到功能验证的重要借鉴和启示。

参考文献

[1] Ling Tang, Jun Zeng… Guowang Xu, Yang Liu. Clin Cancer Res; 24(2) January 15, 2018