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ACS Nano:逐层组装的DNA线框纳米结构用于肿瘤高效成像和靶向治疗

来源:分子科学与生物医学实验室MBL 阅读数:111 时间:2020-12-10 17:27:40
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Dan Wang et al. Hierarchical Fabrication of DNA Wireframe Nanoarchitectures for Efficient Cancer Imaging and Targeted Therapy.

ACS Nano, 2020, DOI: 10.1021/acsnano.0c07495

第一作者:王丹(湖南大学MBL在读博士),彭瑞资(湖南大学博士后),彭咏波(湖南大学博士后)

通讯作者:谭蔚泓(湖南大学),王雪强(湖南大学),柯勇刚(美国埃默里大学)

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引言

    小分子药物在癌症治疗中发挥着至关重要的作用,但其固有的溶解性差和系统毒性等局限性大幅降低了其临床应用,并造成严重的毒副作用。针对上述问题,纳米药物递送载体包括有机聚合物,无机纳米颗粒,脂质体等得到系统性研究,并建立了相应的小分子化疗药物递送策略。但是,这些合成材料的生物相容性低,难以生物降解并具有一定的免疫原性风险。对于大多数纳米药物载体,尤其是基于聚合物的药物递送体系而言,难以控制其总体分子量和纳米尺寸,进而导致药物与载体的比率异质性高、可重复性差等问题。此类问题极大阻碍了纳米药物递送载体在精准医学和临床试验中的广泛应用。

    因此开发新的靶向药物系统用于小分子抗癌药物的精确、高效递送对于实现癌症的有效治疗至关重要。DNA纳米结构具有高度的可设计,可寻址,可预测,可编程性,已被广泛用于生物传感,分子成像,蛋白调控,货物分拣抓释和药物递送等众多研究领域。三维DNA纳米结构相对于一维和二维纳米结构具备更加优异的空间定位能力和可设计的多价优势。DNA折纸结构是DNA纳米技术领域的重大突破之一,可按照预先设计程序化组装形成尺寸和三维形状精准可控的DNA纳米结构。目前,已开发出多种DNA折纸结构用于实现多个药物的有效装载和刺激-响应型释放。但DNA折纸结构的构建成本高昂,含有大量无法驱使的订书钉链且存在易于被核酶降解等问题,因此极大阻碍了其临床应用。DNA多面体结构具有易于组装、结构精确可控、稳定性好、空间定位明确和易于内化的特点而得到广泛研究。其作为药物载体可在所需位置实现药物分子的精确装载,从而为分子医学研究提供有效技术支撑。不过针对常见的由四条链围成的四面体,其在载药量和可编程的位点方面受到限制。

    针对以上现状,湖南大学谭蔚泓院士、王雪强教授与埃默里大学柯勇刚教授等人合作,采用分层自组装策略制备了由DNA八面体线框和药物功能化的核酸适体Sgc8c组成的三维的三层核-壳纳米结构,该结构具有末端隐藏(nick-hidden)的高稳定性,药物分子不可及的防突释性质以及多价的刚性特点,实现了对结直肠癌的精准成像、高选择性和肿瘤深层药物(CA4)递送和更安全的靶向治疗。


02

设计的原理和特点

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    作者通过粘性末端杂交技术可将6个四通DNA分子砌块(Four-way junction, DNA tile)作为顶点杂交可形成DNA八面体结构。在该八面体引入功能化的杂交臂,并与自动化合成的核酸适体-CA4偶联物(CA4-FS)杂交可组装成核-药-壳三层三维纳米结构CA4-Oct。相对于传统的多面体靶向药物,该设计具备如下优势:1)外“壳”层的核酸适体Sgc8c具有特异性识别肿瘤细胞膜蛋白PTK7的能力,并与与其高亲和力结合,发挥CA4-Oct主动靶向能力。与单价核酸适体药物偶联物CA4-FS相比,CA4-Oct具备多价配体(最高24个)的协同识别作用,大幅提升了其识别、结合受体的能力和细胞内吞能力;2)该核-药-壳三层三维纳米结构可通过EPR效应,实现对肿瘤的被动靶向,进一步增强其在肿瘤组织的选择性富集;3) CA4则位于八面体“核”与核酸适体“壳”之间,防止其在血清中的直接暴露,以避免因药物突释而引发的毒副作用; 4)该纳米药物的核心八面体结构具有较好的刚性和致密性,有助于柔性单链CA4-FS对实体瘤的深层递送,以大幅提升实体瘤抑瘤效果。


03

图文数据

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图1. CA4-Oct的构建和表征。A. AGE凝胶电泳实验证明八面体的成功组装。B. CA4-Oct的AFM图。C. 全负载CA4-Oct和半负载hCA4-Oct的组装凝胶电泳验证实验。D. 相关结构的DLS粒径分布。该实验证明CA4-Oct的成功合成和组装,具有约30 nm的水合粒径,具备EPR效应赋予的被动靶向能力。


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图2. CA4-Oct的细胞内化和肿瘤球穿透性表征。A-B. 等药物等荧光分子量条件下,阳性细胞HCT116对各DNA材料的定量摄取结果。C-D. CA4-Oct相对于CA4-FS的细胞选择性表征。E-F. 3D肿瘤球穿透性的可视化和定量表征。该实验证明CA4-Oct拥有比单链CA4-FS等其他对照组更高的内化量和肿瘤穿透深度,并且具有更好的靶细胞选择性,这可能得益于刚性的内核八面体结构和多价核酸适体的主导靶向设计。


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图3. A. 2种细胞,2种孵育方式(8h孵育后洗涤或不洗涤,随后孵育到48h),5个浓度,8种材料下的2x2矩阵细胞活率热图。B-G. 阳性细胞GFP-HCT116与阴性细胞NCM460共培养的流式凋亡实验。短时间孵育条件下,CA4-Oct比CA4-FS有更好的靶细胞毒性和同水平的阴性细胞安全性;长时间孵育条件下,CA4-FS更易被降解因而表现出对阴性细胞的脱靶毒性,而得益于CA4-Oct抗酶切稳定性,其对阴性细胞的细胞毒性比CA4-FS大幅降低。


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图4. CA4-Oct的移植瘤成像。A-B. 不同时间点下CA4-Oct和对照组对小鼠在活体和离体下荧光成像。CA4-Oct比CA4-FS及Cy5有更长的保留时间和聚集浓度,定量实验证明CA4-Oct在肿瘤和正常器官的蓄积比例比CA4-FS更高。C-D.不同时间点肿瘤切片的染色表征穿透性,FITC-CD31表示血管位置,Cy5越多,离FITC越远表示渗透效果越好。CA4-Oct在离体的肿瘤切片实验中证实有更深的肿瘤穿透深度,CA4-FS则在血管内部和附近位置。

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图5. CA4-Oct对裸鼠异种移植瘤的治疗效果。A-E. 不同材料尾静脉注射后对肿瘤尺寸和组织大小的监测。实验结果从宏观角度表明CA4-Oct与CA4-FS,CA4相比具有更好治疗效果和更高的安全性。F-G. 材料对处死后小鼠肿瘤组织的细胞凋亡和细胞增殖的可视化和定量表征。实验结果从微观角度表明CA4-Oct有着比CA4-FS,CA4对肿瘤组织更好的诱导死细胞凋亡和抑制细胞增殖的能力。H. 肝切片的HE染色,箭头表示淋巴浸润。I. 肾切片的HE染色, 箭头表示细胞脱落和扩张。实验结果表明CA4-Oct有着与PBS注射相当的安全性,而CA4-FS和CA4则造成一定的炎症反应和正常细胞的溶胀,脱落和凋亡行为。


04

总结与展望

    本工作从改善小分子药物递送和重塑DNA-药物偶联物的分子设计出发,通过分层自组装策略构建了以刚性DNA八面体为内核,多价适体为壳层,小分子药物包裹于中间层的三层核-药-壳三维DNA纳米药物。CA4-Oct的这一独特设计重塑了经典ApDC即单链CA4-FS的递送策略,该结构表现出更好的生物稳定性,更高的细胞内化能力,出色的成像特性以及更深的肿瘤渗透性,从而获得更优异的肿瘤成像和靶向治疗效果。虽然这种三维DNA纳米药物为癌症靶向治疗提供了新型技术支持,但基于DNA和小分子药物的分子工程化尚处于起步阶段,其在体内的药物分布和代谢途径还需更加深入、系统的研究,以实现对该靶向药物体系的充分认识与评估。