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原来磁珠在核酸提取中是这样工作的

来源: 纳微科技 阅读数:203 时间:2020-05-12 13:44:15

自今年一月以来,新冠疫情席卷全球。截至2020年5月12日,全世界212个国家和地区共报告确诊病例数4,253,802人,其中死亡病例287,250人,死亡率接近7%(注1)。本次新冠疫情对社会经济的冲击是史无前例的。

新冠肺炎疫情地图(来源于新浪新闻)
随着疫情相关信息的传播,许多先前不为大众所知的诊断行业专业名词逐渐变得家喻户晓,如核酸检测、试剂盒、咽拭子、假阴性等等。

那么,进行一次新冠病毒核酸检测的操作步骤是怎样的?为什么偏爱磁珠法进行核酸提取?


为此,北京协和医院在2月初受卫健委委托,录制了一段18分35秒核酸检测标准操作流程点击查看操作流程视频)。

简言之,核酸检测流程大体分为三步:


采样。从人体的呼吸道或其他部位采集可能含有病毒的样本。


提取。将病毒核酸从样本中提取出来,与其他物质分离。


检测。通过荧光定量PCR法检测提取到的病毒含量。

在疫情初起的时候,由于时间紧、任务重、研发周期短等原因,第一批检测试剂盒质量参差不齐,出现了很多起检测三次、四次之后才检出病毒核酸阳性的新闻。这种假阴性问题的出现,与上述三个步骤的每一个步骤均有关系,而其中提取步骤的影响往往被人们所忽视。

上述视频中主要介绍的是离心柱法,这是一种手动操作方法,从视频中可以看出其时间很长,操作繁琐,每次只能处理一个样本,而且需要多次开盖,不仅效率较低,还增加操作人员感染的风险。

事实上,由于检测机构每天需要处理大量样本,大都是采用自动化核酸提取仪配套磁珠法核酸提取试剂盒的方式进行核酸提取步骤。

磁珠既为核酸提取的必备工具之一,那么,何为磁珠?如何进行核酸提取?如何评估提取效果?


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磁珠法核酸提取基本原理


首先,磁珠是一类特殊的纳微米材料,它们的尺寸通常在零点几微米到几微米之间,仅为一根头发丝直径的十几分之一到几十分之一,肉眼是无法观测到单个磁珠的。

其次,它们具有超顺磁性,在磁场中可以向一侧迅速移动,聚集在一起,而去除磁场后又能够迅速恢复到分散状态。

最后,用于核酸提取的磁珠表面具有特定的性质,在某些条件下能够将病毒核酸吸附在表面,在另一些条件下又能将病毒核酸从表面释放下来,用于后续的检测步骤。


(图1:左:MS磁珠的TEM;中:MS磁珠的SEM;右:MS磁珠在管子里无磁铁时分散和有磁铁时向一侧聚集的图片;说明:纳微核酸提取磁珠的电镜图片及其在磁场中的移动)


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如何评估磁珠法提取核酸的效果? 


笔者个人认为,可以按照PQR三原则法进行评价。

P指的是Purity(纯度),具体而言就是磁珠提取后的核酸中含有多少非核酸类的杂质残留,如蛋白、盐、多糖等。该指标通常用吸光度比值(A260/A280和A260/A230)来衡量。

Q指的是Quality(质量),磁珠提取后的核酸尤其是较长的基因组核酸应保持其完整性,不应出现断裂或降解等现象。该指标可通过简单的凝胶电泳或者复杂一些的特定PCR及微流控芯片(如Agilent Bioanalyzer)进行评估。

R指的是Recovery(收率),磁珠提取过程应当尽量将所有的核酸都能从样本中提取出来。高收率对于核酸检测尤其是疾病早期检测的灵敏度至关重要,在疾病早期,样本中的病原体核酸含量通常较低,如果不能高效率地提取到所有核酸,那么很容易出现假阴性,导致漏检。


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磁珠如何与核酸结合,实现提取功能? 



这就涉及到比较深入的生物化学知识。核酸作为一种生物大分子,之所以能够在水溶液中稳定分散不沉淀,是由于三种非共价作用力的存在:(1)静电相互作用(2)范德华力(3)氢键

核酸分子具有多个磷酸基团,呈现高度负电性,分子间互相排斥从而避免发生团聚。此外,核酸分子在水溶液中通过氢键与范德华力结合了大量的水分子在其周围,形成一个水化层,也阻止了分子间的聚集。因此,要使得核酸分子结合到磁珠表面,就必须削弱上述作用力,屏蔽溶液中的静电斥力,同时破坏核酸分子表面的水化层,使其能够与磁珠表面相接触,进而产生吸附。

综上所述,磁珠表面的性质对于核酸提取至关重要。


国内目前生产磁珠法核酸提取试剂盒的厂家大小百余家,所用的磁珠按照表面性质可分为以下三类:


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硅羟基磁珠

这是一类使用最为广泛的磁珠。使用硅羟基磁珠提取核酸时,通常需要高浓度的离液盐(NaI、NaClO4、GuHCl、GuSCN等)。高浓度的盐离子能够有效屏蔽溶液中的静电斥力。同时,离液盐离子还能竞争性地与磁珠表面以及核酸分子相结合,破坏二者表面原有的水化层,促进磁珠表面与核酸分子的吸附(氢键+范德华力)。由于常用的离液盐如胍基离子对PCR有抑制作用,因此它们必须在后续的洗涤步骤中被去除,去除效果可通过吸光度比值进行监控。


(图2:MS050硅羟基磁珠用于质粒DNA提取,说明:纳微MS050硅羟基磁珠提取后的DNA完整性良好,超螺旋形式的质粒DNA最多)


(图3:MS070硅羟基磁珠用于血清中游离DNA提取,说明:纳微MS070硅羟基磁珠可以从血清中提取游离DNA(片段长度156 bp),PCR显示平均提取效率可达85%)

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羧基磁珠

这类磁珠除了能够像硅羟基磁珠一样在高浓度离液盐环境中结合核酸分子之外,还能通过另一种特殊的机制与核酸分子结合。通过向溶液中加入一定浓度的PEG和NaCl,可以使得核酸分子从伸展的构象逐渐蜷缩成小球状,其上的负电荷也大部分被屏蔽掉,促使核酸分子吸附到磁珠上。核酸分子的分子量越大,越倾向于发生这种从伸展线团向蜷缩小球的构象变化,因此,通过调节盐溶液与核酸样本的体积比,能够实现较大分子量的核酸片段在羧基磁珠表面的优先吸附,达到所谓的片段筛选效应

图4:MS050羧基磁珠用于片段筛选,说明:纳微MS050羧基磁珠以DNA ladder为样本,可以实现尺寸在100 – 1500 bp之间的左侧筛选(去除小片段)和右侧筛选(去除大片段))


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氨基/咪唑基等正电荷磁珠

此类磁珠能够方便地通过调节pH实现核酸分子在表面的可逆结合。不过,由于正电荷表面对核酸分子吸附过强,容易导致收率偏低,因此正电荷磁珠的使用反而不如硅羟基及羧基磁珠广泛。

纳微公司专注核酸提取磁珠开发十余年,生产的MS系列核酸提取磁珠为核壳结构,外形呈球形,粒径较为均一,平均粒径在0.5 μm左右,每批产能达400 – 500 g。与无定形磁珠相比,球形磁珠在磁场中移动速率一致,不会出现因磁吸分离不完全导致样本损失的现象。目前,MS050-Hydroxyl硅羟基磁珠与MS050-Carboxyl羧基磁珠均在病毒核酸提取试剂盒中有良好的应用。