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屈锋教授:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究

来源:分析化学 阅读数:880 时间:2018-10-25 16:01:28

杨歌, 朱超, 刘晓慧, 王勇, 屈锋 

北京理工大学生命学院, 北京 100081


毛细管电泳(CE)被认为是核酸适配体筛选的高效方法,其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离高效,样品用量少,筛选成本低。但由于小分子靶与核酸的结合位点少,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,通常认为CE-SELEX不适用于筛选小分子靶标的适配体。本研究建立了基于CE-SELEX的盐酸克伦特罗靶标的的适配体筛选方法。将80 nt的ssDNA库与盐酸克伦特罗特混合孵育,通过CZE-UV分离混合物。收集ssDNA库峰前的馏分,通过PCR扩增和ssDNA制备,完成第一轮筛选。将次级核酸库经过3轮筛选,获得10条ssDNA序列。选择3条亲和力较强的序列Apt 4、Apt 7、Apt 12,通过CE-LIF测定其与盐酸克伦特罗的Kd分别为9.315×10-7 mol/L、1.040×10-6 mol/L和1.143×10-5 mol/L。软件分析表明,上述3条序列均可形成茎环二级结构,其中Apt 4茎环结构的自由能最低,结构最稳定。以沙丁胺醇为对照,验证了3条序列,具有较高的特异性。


关键词:   盐酸克伦特罗, 核酸适配体筛选, 毛细管电泳, 毛细管电泳-指数富集配体系统进化

1    引言

核酸适配体(Aptamer)由几十个核苷酸组成,具有分子量小、易穿透细胞膜、化学性质稳定、容易制备和修饰等特点[1~3]。适配体结合的靶标范围广泛,包括离子、小分子、蛋白质、细胞和微生物等。适配体具有广泛的应用前景和潜在需求,近年来是生物学、医学、药学和分析化学领域的研究热点之一[4]。蛋白质、细胞和微生物等靶标的Aptamer可用于疾病诊断和治疗、药物研发、蛋白质组学以及基因表达调控机理研究[5]。而药物、氨基酸、抗生素等小分子靶标的适配体通常作为化学和生物传感器的识别分子用于食品和环境检测以及生物分析等领域[6]。目前已报道的靶标超过500种,适配体超过2300种[7],但具有实际应用价值的适配体还不多。研究者开发了各种新的筛选方法和技术,以提高适配体的筛选效率和适配体的性能[8]。毛细管电泳(Capillary electrophoresis, CE)作为一种高效、快速、样品用量少的微量分析方法,在蛋白质的适配体筛选中应用较多(即CE-SELEX)[9~12],被认为是核酸适配体筛选的最高效方法。其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离效率高、分离速度快、样品用量少、筛选成本低。由于小分子靶标与核酸的结合位点少,亲和力较低,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,所以小分子-核酸库的复合物分离存在困难,通常认为CE-SELEX用于小分子的适配体筛选有难度。目前,仅有Bowser小组利用CE筛选N-甲基卟啉二丙酸的适配体的报道[13]


本课题组长期从事毛细管电泳筛选多尺度靶标(蛋白质[14]、微生物[15]、细胞和小分子)的核酸适配体的筛选方法研究。盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride, Clen, C12H18Cl2N2O·HCl,Mr=313.7 g/mol),又称“瘦肉精”,非法使用时可提高猪的瘦肉率,是我国食品安全检测的重要指标。本研究建立了CE筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的系统方法和流程。选择80 nt的ssDNA库与盐酸克伦特罗混合孵育,通过CE-UV分离后,经PCR扩增和ssDNA制备,完成一轮筛选。重复筛选4轮后,克隆测序获得10条ssDNA序列。选择3条亲和力较强的序列,通过CE-LIF测定其解离常数Kd。进一步以分子结构和分子量与盐酸克伦特罗相似的沙丁胺醇(Salbutamol, Sal,C13H21NO3,Mr=239.31 g/mol)为对照分子(图 1),验证了筛选的序列对盐酸克伦特罗的特异性。同时建立了胶体金比色分析(AuNPs)与氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)介导的适配体荧光“猝灭-恢复”两种方法,可快速验证所筛选适配体的亲和力和特异性。结果表明,CE-SELEX可用于一些小分子的适配体高效快速筛选,本方法为小分子的适配体筛选提供了参考。


图 1. 盐酸克仑特罗(A)及沙丁胺醇(B)的结构式

2    实验部分

2.1    仪器与试剂

BeckmanP/ACETM MDQ配紫外和激光诱导荧光(LIF)检测器(美国贝克曼库尔特有限公司); Agilent 7100配DAD检测器(美国安捷伦科技有限公司); S1000TM Thermal Cycler型PCR仪、iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System、电泳仪和电泳槽(美国Bio-Rad公司);G:BOX型凝胶成像系统(美国Syngene公司); NanoDrop 2000c紫外-可见光谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)。熔融石英毛细管(邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司)。


盐酸克伦特罗(98.5%,Dr. Ehrenstorfer GmbH, Germany); 80 nt ssDNA核酸库:5′-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-40N-CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA-3′(两端为20 nt引物区固定序列,中间为40 nt随机序列),FAM标记的ssDNA库(FAM-ssDNA library); 引物P1:5′-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3′,标记荧光的引物5′-FAM-P1:FAM-5′-AGCA GCAC AGAG GTCA GATG-3′,引物P2:5′-TTCA CGGT AGCA CGCA TAGG-3′(生工生物工程(上海)股份有限公司); 2×Taq Plus PCR Master Mix (天根生化科技有限公司); TransStartTM Top Green q-PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司); 核酸染料Gold View(北京鼎国昌盛生物技术有限公司); HCl、NaOH、NaCl、KCl、MgCl2·6H2O(分析纯,北京化工厂); 三羟甲基氨基甲烷(Tris,赛默飞世尔公司); 氧化石墨烯(GO)溶液(北京拜尔迪生物技术有限公司); 实验用水均为某品牌蒸馏水。


2.2    实验方法

2.2.1    溶液配制

以30 mmol/L HCl溶解盐酸克伦特罗,配制成0.8 mmol/L的储备液。干粉状核酸库用50 mmol/L硼酸盐溶液(pH 8.2)溶解,配制成100 μmol/L核酸库。使用前,将100 μmol/L核酸库在94℃变性10 min,然后以0.5℃/s缓慢冷却至25℃。将盐酸克伦特罗与核酸库溶液于37℃孵育30 min后,进行CE分析。


2.2.2    毛细管电泳

75 μm熔融石英毛细管(有效长度/总长40 cm/50.2 cm),首次使用时分别用1 mol/L、0.1 mol/L NaOH和去离子水分别冲洗30 min。两次实验间和实验结束后,依次用0.1 mol/L NaOH和H2O冲洗5 min。分析条件:50 mmol/L硼酸盐溶液(pH 8.2),20 kV,UV 214 nm; LIF检测激发波长:488 nm,发射波长:520 nm; 进样压力3.45 kPa,5 s。复合物分离收集,15 kV,混合物进样6.89 kPa,4 s。收集0 ~5.9 min(Before ssDNA library)溶液至50 μL的PCR用溶液。重复收集2次。


2.2.3    PCR扩增条件

(1) 常规PCR扩增增加模板量  因收集的复合物中ssDNA含量较低,需经PCR扩增增大模板量,对PCR需进行条件优化[16](见3.3节)。PCR条件:总体积50 μL,2×Taq Plus PCR Master Mix 25 μL,300 nmol/L引物P1、P2为6 μL。PCR条件:94℃预变性1 min,94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环15次后72℃后延伸5 min。(2)不对称PCR制备次级库  将上述PCR产物经2.2.4方法浓缩和纯化后作为模板,进行不对称PCR扩增,制备次级核酸库。优化的不对称PCR条件:总体积,100 μL,其中2×Taq Plus PCR Master Mix 50 μL,引物P1为1.8 μmol/L,引物P2为60 nmol/L。PCR条件:94℃预变性1 min,94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环40次后,72℃后延伸5 min。


2.2.4    PCR产物的浓缩和纯化

PCR及不对称PCR后,需对产物进行浓缩和纯化,分别获得不对称PCR所用的模板或用于下轮次筛选的次级库。浓缩和纯化方法:PCR扩增的DNA产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳分离,60 V,40 min; 切下所需凝胶转移到1.5 mL离心管中,12000 r/min离心1 min,-20℃冰冻20 min。取出冻结的凝胶立即捣碎后,加入500 μL水,振摇200次。向管中加入500 μL Tris饱和醇酚,振摇200次,于4℃以12000 r/min离心15 min。将上清液加入含有500 μL氯仿-异戊醇(24:1, V/V)的1.5 mL离心管中,振摇200次,于4℃以12000 r/min离心15 min。弃去上清液后,将沉淀置于干净吸水纸,干燥后得到核酸序列,用于后续筛选或不对称PCR。


2.2.5    核酸序列分析与亲和力表征方法

(1) 核酸序列由奥美德诺(北京)基因科技有限公司测定  使用DNAMAN软件(Lynnon Biosoft, USA)分析序列的二级结构。(2)以CE-LIF表征亲和力  测定加入Clen前后,ssDNA峰面积的变化百分数(RA)为:RA(%)=(I0-I1)/I0×100%,其中,I0为1 μmol/L ssDNA的峰面积,I1为加入不同浓度Clen后的ssDNA峰面积。RA越大,表示靶标与ssDNA的相对亲和力越强。(3)平衡解离常数Kd测定1 μmol/L ssDNA中加入不同浓度(0~20 μmol/L) Clen,计算RA,利用软件GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA),按照1:1结合模型,对RA随Clen浓度变化的非线性饱和曲线拟合,求算解离常数。


2.2.6    AuNPs比色分析验证亲和力

(1) AuNPs制备  采用柠檬酸盐还原法制备AuNPs,加热100 mL 1 mmol/L HAuCl4溶液至沸腾; 而后在同步搅拌下快速注射194 mmol/L柠檬酸钠溶液2 mL,沸腾15 min后取出反应烧瓶,并将反应溶液在缓慢冷却至室温。(2) AuNPs比色分析方法分析核酸序列亲和力  在96孔板中,将25 μL 0.1 μmol/L的核酸序列分别与等体积且浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5和10 μmol/L的Clen室温孵育15 min,加入10 μL 900 mmol/L NaCl溶液,观察胶体金溶液颜色变化。(3) 520和620 nm处吸光度测定  使用紫外-可见光谱仪测定AuNP溶液在520和620 nm波长处的吸光度。


2.2.7    GO-毛细管电泳法分析验证亲和力

(1) 孵育缓冲溶液配制  孵育缓冲溶液为20 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl, 50 mmol/L K+, 100 mmol/L Na+, 5 mmol/L Mg2+; (2)样品配制  将GO溶液用(1)中的孵育缓冲溶液稀释至浓度为60 μg/mL,于4℃保存备用; 用孵育缓冲液将核酸序列溶液稀释至0.3 μmol/L,将Clen稀释至0.3、0.6、3、6和15 μmol/L。(3) GO方法分析核酸序列亲和力  各取稀释后的核酸序列、GO与Clen溶液10 μL,在室温下混合孵育15 min后,通过2.2.2节的CE-LIF方法检测荧光猝灭-恢复情况。


3    结果与讨论

3.1    筛选流程

图 2为Clen的适配体筛选流程。CE分离和收集靶标-ssDNA复合物组分后,进行PCR扩增和ssDNA浓缩和纯化,用于不对称PCR的模板。不对称PCR扩增后,浓缩和纯化的产物为次级库,用于下一轮筛选。各轮次级库用CE-LIF表征筛选效率。经过4轮筛选的产物采用克隆测序得到适配体序列。利用CE-UV,通过RA初步比较其与盐酸克仑特罗的亲和力。选择亲和力较好的序列,通过CE-LIF测定各序列的解离常数Kd


图 2. CE筛选Clen适配体的流程图

3.2    Clen与ssDNA库孵育混合物的CZE分析

UV检测下,Clen和80 nt ssDNA库分别在中性标记物DMSO前后出峰(图 3A),说明二者在溶液中分别带正、负电荷。ssDNA库与Clen孵育后,游离的Clen和ssDNA峰均无明显降低,也未观察到明显的复合物峰。LIF检测下,20 nmol/L的FAM-ssDNA库中加入Clen后,增加Clen浓度使ssDNA库峰面积降低,面积降低百分比为42.65%(图 3B)。在ssDNA峰前面,可见产生的包峰,说明二者产生相互作用,形成了复合物。因复合物的荷质比小于ssDNA核酸库,故在ssDNA核酸库前出峰。因此,利用CE-LIF可灵敏检测到ssDNA库的峰降低以及Clen-ssDNA复合物峰。


图 3. Clen与ssDNA核酸库的毛细管电泳分析:(A) CE-UV检测的电泳图从下往上依次为:DMSO、80 μmol/L Clen、5 μmol/L 80 nt ssDNA library、80 μmol/L Clen + 5 μmol/L 80 nt ssDNA library; (B) CE-LIF检测的电泳图 20 nmol/L FAM-ssDNA库与Clen混合物分析,Clen浓度从下往上依次为0、160、320和400 μmol/L, 体系在37℃混合孵育30 min,室温放置10 min

3.3    Clen-ssDNA复合物收集与PCR条件优化

由于ssDNA核酸库中序列数与多样性可能高达1015,使用的靶标浓度低于ssDNA时有利于提高各轮次筛选的次级库收敛度[17]。将3.2 μmol/L Clen与20 μmol/L ssDNA等体积混合孵育后进样,收集0~5.9 min的组分(图 4A),即ssDNA库前段包含Clen-ssDNA复合物的馏分。为方便收集和增加收集量,进行连续5次收集。收集的组分进行PCR扩增,并优化PCR的退火温度、循环次数条件。预设循环数30,分别在退火温度55℃、56.5℃、58.9℃、61.7℃、65.6℃、68.7℃、70.8℃、72℃下进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图 4B),退火温度为58.9~61.7℃时,DNA条带较亮,且亮度相近,说明PCR产物量相差不大。继续升高温度,则产物条带变暗,产物量减少,因此选择退火温度为60℃。本实验通过荧光实时定量PCR(Q-PCR)优化循环数。产物荧光信号随扩增轮次增加,在第15次循环达到最高值(图 4C)。


图 4. (A) CE-UV收集复合物; (B) PCR温度优化M: DNA Marker,a~h退火温度分别为:a-72.0℃,b-70.8℃,c-68.7℃,d-65.6℃,e-61.7℃,f-58.9℃,g-56.5℃,h-55.0℃; (C) Q-PCR优化循环数(平行3次); (D) PCR产物的CE-LIF分析

对上游P1引物采用5′-FAM标记,其PCR产物可经CE-LIF检测。由图 4D可见,过剩的P1引物峰和扩增产物dsDNA的峰,二者迁移时间有明显差异。产物中仅有引物峰和dsDNA峰,说明优化的PCR条件下,没有副产物ss-dsDNA形成。而高灵敏的CE-LIF可用于快速检测PCR体系中的P1引物、PCR产物以及副产物,辅助PCR条件优化。


3.4    制备次级文库

通过不对称PCR扩增制备ssDNA次级库。将3.3节的PCR产物经浓缩和纯化后,作为次级库制备的不对称PCR的模板,进一步扩增得到大量ssDNA。优化不对称PCR的上下引物比例,可控制扩增生成的ssDNA。考察上下游引物浓度比P1:P2分别为20:1、30:1和40:1时的扩增情况,经过40循环数扩增。如图 5A所示,P1:P2=30:1时能够获得更多的PCR产物,且不对称PCR产物与80 nt ssDNA库条带的位置一致,未产生其他序列。由于不对称PCR反应后的混合体系复杂,不能直接用作次级库进行后续筛选,需对不对称PCR产物中的单链ssDNA进一步浓缩和纯化。按2.2.4节的方法浓缩纯化ssDNA,对其进行CE表征,纯化产物为单一的信号峰,且与对照的ssDNA库迁移时间一致(如图 5B),说明纯化效果较好。本研究以纯化后的不对称PCR产物ssDNA作为次级库并用于下一轮次的筛选。


图 5. (A) 不对称PCR的引物浓度比例优化,M: DNA Marker,A-C上下游引物浓度比分别为:a-20:1,b-30:1,c-40:1; (B) CE-UV表征纯化后次级核酸库; (C)各筛选轮次ssDNA库与Clen的亲和力比较

3.5    4轮筛选的ssDNA库与Clen的亲和力比较

将4轮筛选分别制备的ssDNA次级库(0.5 μmol/L)与80 μmol/L Clen混合,以ssDNA峰面积变化RA为指标比较多轮筛选的ssDNA的亲和力,RA越大,靶标与ssDNA的亲和力越强。如图 5C所示,1~3轮,次级库与靶标的亲和力随筛选轮次增加。4轮筛选后,核酸结合比例有所降低,说明亲和力已不再提高。3轮筛选的亲和力最优与[9, 10, 13, 18]报道一致,说明CE-SELEX的筛选效率高,3轮筛选即可获得亲和力最优的适配体。考虑到轮次筛选少可能引起ssDNA序列的多样性,会给后续测序带来高成本,并考虑后续研究的结果比较,本研究采用了第4轮筛选的产物进行序列分析和亲和力评价。


3.6    筛选序列分析与亲和力测定

3.6.1    筛选序列的相对亲和力比较

将第4轮筛选产物进行克隆测序,得到10条序列,如表 1所示。用软件DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft, USA)计算各序列的碱基组成,发现(G+C)含量普遍较高,与文献[6]报道一致。将1 μmol/L ssDNA与80 μmol/L Clen 25℃混合孵育10 min,加入Clen后,ssDNA与Clen结合形成复合物,使游离ssDNA减少,峰面积降低。通过CE-UV分析,比较加入Clen前后ssDNA峰面积变化RA比较各序列的相对亲和力。由表 1可见,RA值最大的3条序列为Apt 4、Apt 7和Apt 12,初步确定它们与靶标的亲和力强于其它序列。



表1 筛选序列及相对峰面积(%)


3.6.2    序列的平衡解离常数测定

利用高灵敏的CE-LIF,测定Apt 4、Apt 7、Apt 12的解离常数Kd。在1 μmol/L FAM标记的Apt 4、Apt 7、Apt 12中分别加入0~20 μmol/L Clen,测定RA。利用GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA)软件,按照1:1结合模型,拟合RA随Clen浓度变化的饱和曲线(图 6),求得Apt 4、Apt 7、Apt 12的解离常数Kd依次为9.315×10-7 mol/L、1.040×10-6 mol/L、1.143×10-5 mol/L,其与文献[8]报道的小分子适配体的解离常数的数量级基本一致。Apt 4的Kd最小,与Clen的亲和力最高。


图 6. 序列的解离常数Kd计算及二级结构

使用DNAMAN 8.0模拟Apt 4、Apt 7、Apt 123种序列的二级结构,其自由能分别为-37.24、-27.63和-21.99 kJ/mol,三者均能形成茎环结构(图 6)。Apt 4的亲和力更强,可能是由于其茎环结构更稳定。


3.7    适配体的特异性验证

以分子结构和分子量与Clen相似的沙丁胺醇(Sal),分析适配体序列的特异性。利用CE-LIF测定加入Sal后的峰面积变化RA%,分析不同浓度沙丁胺醇与3条序列的相互作用。利用GraphPad Prism 6拟合饱和曲线,分别得到其最大结合量Bmax,并与Clen靶标的结果比较(图 7)。3条序列与Clen的Bmax(>100 μmol/L)均明显高于与Sal结合时的Bmax (Apt 4、Apt 7、Apt 12分别为2.22、9.58和17.61 μmol/L)。说明3条序列Apt 4、Apt 7、Apt 12与Clen的结合具特异性,且Apt 4的特异性较其它两条序列更高。


图 7. 三条序列结合盐酸克伦特罗与沙丁胺醇的Bmax比较

3.8    AuNPs比色法分析适配体亲和力与特异性

在25 μL AuNPs溶液中加入等体积的0.1 μmol/L适配体,室温混合孵育15 min后,加入NaCl溶液,AuNPs因适配体保护而不发生沉聚,故其颜色保持酒红色。在适配体包被的AuNPs溶液中,分别加入0.1、0.2、0.5、1、2、5和10 μmol/L的Clen,室温孵育15 min后加入NaCl溶液,结果可见,随着Clen浓度增加,AuNPs溶液颜色由酒红色逐渐转变为蓝色(图 8A)。当Clen浓度为0.2 μmol/L时,结合了Apt 4的AuNPs溶液转变为紫色,而加入Apt 7或Apt 12时,Clen浓度为0.5 μmol/L时AuNPs转变为紫色。说明靶标与Apt4的亲和力高于Apt7、Apt12,与CE测定亲和力结果一致。分别在520和620 nm波长处测定AuNPs溶液吸收值(图 8B)。Clen浓度为0~0.5 μmol/L范围时,A520/A620的比值随Clen浓度增加而降低。


图 8. AuNPs比色分析适配体亲和力与特异性:(A) Clen浓度对AuNPs溶液颜色影响; (B) Clen浓度增加对AuNPs溶液A520/A620的影响; (C) Apt 4与Apt 12的特异性分析(重复3次)

进一步通过AuNPs比色分析表征适配体的特异性。在3条适配体中选择亲和力最高的Apt 4与最低的Apt 12进行特异性比较,结果如图 8C所示。吸附了Apt 4、Apt 12的AuNPs溶液中分别加入1 μmol/L的Clen与Sal,加入1 μmol/L Clen的AuNPs溶液呈蓝色,而加入1 μmol/L Sal的AuNPs溶液仍保持酒红色,说明Apt 4、Apt 12均不能结合Sal,两条适配体具有特异性。


3.9    GO-毛细管电泳法分析适配体亲和力

通过GO毛细管电泳法,进一步验证Clen与适配体的亲和力。将0.1 μmol/L 3种适配体分别与20 μg/mL GO在室温条件下缓冲体系中混合孵育15 min,再在孵育溶液中分别加入0.1、0.2、1、2和5 μmol/L的Clen。分别对适配体、适配体/GO溶液、适配体/GO/Clen溶液进行CE-LIF检测。结果如图 9所示,在0.1 μmol/L适配体中加入20 μg/mL GO时,适配体的荧光发生猝灭,其峰面积降低达98%以上。进一步加入Clen时,随Clen浓度增加,荧光强度逐渐恢复。加入5 μmol/L Clen时,荧光几乎完全恢复。上述结果表明,与GO结合的适配体,因Clen加入而从GO上脱落,Clen从GO上竞争结合适配体,说明其与适配体具有更强的相互作用。3条适配体中,Apt12的荧光恢复程度最低,说明其与Clen的亲和力最弱,与CE方法和纳米金比色法一致。


图 9. GO-毛细管电泳法比较适配体与Clen结合的亲和力:(A) Apt 4; (B) Apt 7; (C) Apt 12;电泳图从下向上为:0.1 μmol/L适配体; 0.1 μmol/L适配体+20 μg/mL GO; 适配体/GO+0.1 μmol/L Clen; +0.2 μmol/L Clen; +1 μmol/L Clen; +2 μmol/L Clen; +5 μmol/L Clen

4    结论

建立了基于CE-UV和CE-LIF筛选和分析盐酸克伦特罗的核酸适配体的方法。CE不仅可用于适配体序列的分离,还可用于PCR产物的分离和表征,以及靶标与各轮筛选次级库的亲和力表征、适配体序列的亲和力和特异性分析。结果表明,建立的CE-SELEX方法可用于适配体的高效快速筛选、筛选过程的条件优化及筛选效率表征。本研究拓展了CE-SELEX在小分子靶标的核酸适配体筛选中的应用,也为建立核酸适配体的标准筛选方法奠定了基础。