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岛津成像质谱显微镜应用专题丨3D肿瘤球

来源: 岛津 阅读数:216 时间:2021-04-25 08:45:13





1.概述


光动力疗法是一种创新癌症替代疗法。使用光敏化合物(光敏剂,PS)后照射肿瘤,PS的活化会导致活性氧形成,随后诱导细胞凋亡。本项目对化合物5,10,15,20-四(3-羟基-苯基)-卟啉(mTHPP)及其钯标记类似物mTHPP-Pd进行了研究(图1)。PS开发过程中的主要问题是化合物的疏水特性阻碍其在组织的渗透。此外,口服化合物需要穿透胃肠道中的粘液层。因此,亟需测定化合物的渗透深度。

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图1:光敏剂5,10,15,20-四(3-羟基-苯基)-卟啉(mTHPP)和钯(II)标记类似物(mTHPP-Pd)的化学结构。

使用3D肿瘤球进行体外药物筛选,可比2D细胞培养更好地模拟肿瘤环境。本研究通过联合使用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)技术,进行元素和分子成像分析,用于研究mTHPP和mTHPP-Pd在3D肿瘤球中的空间分布和浓度。


2.材料与方法


肿瘤球

使用Liquid overlay技术制备人结肠癌细胞系HT29的稳定肿瘤球 [1]。根据已知文献合成光敏剂mTHPP和mTHPP-Pd [2],将肿瘤球与溶解的PS共同孵育24 h, PS的终浓度为5 μM。

样品制备

在MALDI-MSI实验中,用Tissue-Tek® O.C.T.包埋肿瘤球并制备14 μm切片,将切片放置于具氧化铟锡涂层的载玻片上。使用乙酸铵缓冲液去除冷冻包埋物,并使用iMLayer™(20分钟,250℃,5•10-2 Pa)升华α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)至组织表面。

在LA-ICP-MS实验中,将经mTHPP-Pd处理的5 μm球体组织切片放在显微镜载玻片上,通过ICP-MS进行检测。采用基体匹配的明胶标准品进行外标法定量。为此,使用10%明胶溶液加钯标准溶液,钯浓度为0.1至100 μg/g。加热标准品后进行均质,切成5 μm的薄片。

仪器设备

使用iMScope TRIO进行分子成像。在大气压下,配备355 nm Nd:YAG激光器的MALDI源以1000 Hz的激光脉冲频率工作。每个像素点进行100次激光扫描。采样电压为3.5 kV,检测器电压为1.9 kV。

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质谱成像与LA-ICPMS多模式成像系统

激光光斑大小为5 μm,激光Fluency为0.068 μJ,x和y方向移动步进为10 μm。在m/z 600-900的正离子模式下获得相应结果。通过MS2实验(使用氩气作为碰撞气体,分离和碰撞诱导的解离时间分别为20和30 ms)对所有已鉴定分子进行验证。

使用LA-ICP-MS进行元素生物成像。将ICPMS-2030四极杆质谱仪与激光剥蚀系统LSX-213 G2 +(Teledyne CETAC)进行联用。该系统配备有213 nm的Nd-YAG激光器,并使用0.8 L/min氦气冲洗剥蚀池。

以20 Hz的频率进行激光扫描,光斑大小为7 μm,扫描速度为21 μm/s。以0.45 L/min的雾化气(氩气)引入HNO3(2% w/v),以改善等离子体的稳定性。ICP-MS配有镍采样锥和截取锥,在碰撞模式下以氦气作为碰撞气体(6 mL/min)。检测同位素31P的积分时间为85 ms,而同位素105Pd和106Pd的积分时间为100 ms。等离子体设置如下:等离子功率1.2 kW,采样深度5 mm,等离子气体9.0 L/min。


3.结果


mTHPP处理肿瘤球MALDI-MS图像如图2所示。在显微图像中,可以看到直径约为550 μm 的球形组织切片。磷脂酰胆碱PC 32:1,PC 34:1和PC 36:1非常适合进行肿瘤组织成像并显示其相关分布信息。mTHPP呈现环形分布,可以将其与肿瘤球的外层细胞精确关联,结果如MALDI-MS图像叠加光学显微图像所示。

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图2:mTHPP处理肿瘤球MALDI-MS图像。

光学显微图像(a),mTHPP的分布(b),两者的叠加图(c)。此外,还显示了TIC均一化后三种磷脂PC 32:1(d)、PC 34:1(e)和PC 36:1(f)的分布。所有分子均检测[M + H] +,并以±0.05的质量窗显示。

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图3:在mTHPP-Pd处理的HT29肿瘤球的同一切片上进行元素和分子成像。

光学显微图像为图(a),图(b)为106Pd的LA-ICP-MS图像,图(c)为PC 34:1的MALDI-MS图像,图(d)为二者叠加图。

PS均匀分布在外层,而非围绕球体分布,且无法渗透至深层组织中。此外,MALDI-MS实验检测到PS完整分子,说明在样品制备过程中PS不会发生分解。

为结合分子信息和直接定量的优势,首先使用MALDI-MS研究了肿瘤球切片,随后使用LA-ICP-MS对其进行研究。mTHPP-Pd孵育肿瘤球分析结果如图3所示。由于ICP-MS分析需要金属标记PS,只能研究用该化合物处理过的球体。相反,无法使用MALDI-MS检测到相应修饰后的分子。由于钯的标记,失去分子倾向的质子化位点,从而影响检测。但MALDI-MS可用于鉴定磷脂。检测到钯浓度最高为10 μg/ g,平均浓度为1.9 μg/ g。此外,PS的分布与前期研究结果相符,并且仅在外部细胞层区域性分布。此外,还检测到前期所述的相关磷脂。

例如,PC 34:1的分布可用于归属组织结构。两种模式均可使用图像叠加,使mTHPP-Pd在富含磷脂的3D肿瘤细胞模型周围的分布清晰可见。


4.结论


成像技术为研究可成为新型肿瘤治疗替代方法的PS在肿瘤球体中的渗透深度提供互补分析方法。分子和元素生物成像的直接结合共同发挥了MALDI-MS和LA-ICP-MS成像的优势。采用这种方法,可以通过MS2对目标物质进行结构鉴定,同时使用基体匹配标准品实现定量。

参考文献

[1] J. Friedrich, C. Seidel, R. Ebner, L.A Kunz-Schughart, Nat. Protoc. 4 (2009) 309–24.

[2] A.-C. Niehoff, A. Moosmann, J. Söbbing, et al., Metallomics. 6 (2014) 77–81.


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