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基于LC-PASEF的集成化非靶向代谢组学解决方案

来源:布鲁克质谱 阅读数:107 时间:2020-06-19 16:51:12

非靶向代谢组学涉及不同的研究领域,如药物开发、表型组学、环境暴露和非靶标筛选等。这些研究虽然研究体系研究目标不甚相同,但却有着相同的研究需求,如差异标志物的寻找、未知化合物的鉴定和化合物的相对定量等。LC-PASEF工作流程结合MetaboScape®软件提供一体化的解决方案,包括批量数据的采集处理、统计学分析、化合物鉴定以及代谢通路分析。同时,还增加了时间序列分析和化合物代谢物预测(基于BioTransformer)的功能。 


实验设计

设置两组时间序列样品:
  1. 不同孵育终止时间(0、5、15、30、45、60、90和120 min)的药物体外代谢肝微粒体模型;

  2. 三种不同细胞使用0、6、14和20天后的培养基。

所有样品经离心稀释后使用布鲁克Elute UPLC-timsTOF Pro进行分析(+ESI, PASEF模式)。

使用MetaboScape® 2021(预发布版本)进行数据分析。


图1:二级谱图覆盖度(A-PASEF,B-Auto MSMS)整个LC梯度的平均谱图

PASEF扫描模式可以大幅提高二级谱图的覆盖度,一次样本采集获得更多化合物的二级谱图,有助于更深的挖掘样品信息。图1给出了同一个培养基样本分别使用PASEF模式和AutoMSMS模式扫描得到的平均谱图(0.3-15.0min)。红色菱形标注的为已采集二级谱图的母离子。可明显看出PASEF模式二级谱图数量远大于传统的AutoMSMS模式。

数据处理

T-Rex 4D是MetaboScape软件独有的算法,用于带有淌度信息LC-PASEF数据的对齐和峰提取。用于化合物鉴定的信息包括准确质量数,同位素峰信息,MS/MS谱图和CCS值。

在MetaboScape软件中可使用SmartFormula、Analyte List、Spectral Library、CCS predict 和BioTransformer等工具对化合物进行鉴定。

1)药物体外代谢肝微粒体模型

使用MetaboScape内嵌软件BioTransformer进行Chlorpromazine氯丙嗪的代谢物的模拟,结果见图2。


图2:使用MetaboScape预测的氯丙嗪代谢物列表

预测结果可直接链接到数据中进行匹配,以Chlorpromazine+O(C17H19ClN2SO,m/z 335.0979)为例,在数据中共匹配到两个可能的结果,保留时间分别为2.03min和2.08min(图3)。


图3:MetaboScape匹配代谢物预测结果


考虑到文献报道中Chlorpromazine+O代谢物可能存在同分异构体(hydroxy-,sulfoxide和N-oxide结构)的情况,对数据提取淌度图,得到图4。淌度图显示2.03min和2.08min的淌度值分别为171.1和176.5,分别为两种不同的代谢物。结合代谢物MS/MS数据库(布鲁克MetaboBASE® Personal Library 3.0)的检索结果,保留时间为2.03min的化合物hydroxy-和sulfoxide结构的二级打分更高,而N-oxide结构的二级谱图匹配度很低。对比实测和预测的CCS值,sulfoxide结构(氯丙嗪亚砜)偏差为1.44%,hydroxy-结构(羟氯丙嗪)偏差为1.84%。故推测2.03min化合物为氯丙嗪亚砜。同理,推测得2.08min代谢物为7-羟基氯丙嗪。


图4:m/z 335.0979的提取淌度图(EIM)


MetaboScape 2021可以给出代谢物丰度随时间变化的可视化结果。图5给出了氯丙嗪亚砜和7-羟基氯丙嗪两种代谢物强度随时间变化的情况。


图5:氯丙嗪亚砜和7-羟基氯丙嗪两种代谢物强度随时间变化的情况


2) 细胞消耗培养基模型

细胞消耗培养基模型,研究在培养细胞的过程中,随着时间的变化,培养基内营养成分的消耗以及新代谢物的生成情况。MetaboScape的时间序列分析功能可用于这一应用,它能够监测代谢物随时间进程的变化,并比较不同培养基之间的差异,自动鉴别细胞培养营养素,包括氨基酸、激素、生长因子、酶抑制剂、维生素、抗生素、核苷酸和脂类等,这些基本都是细胞合成蛋白质过程所需的物质。

在本次实验中我们发现随着孵育时间的增加大部分的氨基酸的含量发生了减少,这是因为细胞在合成蛋白质的过程中消耗了大量的氨基酸。图6 显示了0 ~ 20天在三种不同的细胞培养基中组氨酸、丝氨酸、鸟嘌呤和腺嘌呤的变化。每种氨基酸在不同的培养基中显示出不同的消耗速率。在第6、14和20天,鸟嘌呤和腺嘌呤均未被检测到,说明在孵育初期,这些化合物就发生了大量的消耗。一般来说,这些时间过程差异可以作为生产质量控制的相关参数。


图6:细胞培养基中氨基酸水平的变化(A – spent media - 23; B – spent media – 40; C – spent media – 10)组氨酸(浅蓝色); 丝氨酸(红色); 鸟嘌呤(绿色)和腺嘌呤(蓝色)


同样的,代谢物的含量变化也可以作为质控的相关参数。图7给出了胞苷酸在三种不同培养基中的产生情况。


图7:细胞培养过程中不同培养基中代谢产物的形成(A – spent media - 23; B – spent media – 40; C – spent media – 10)

结论

布鲁克作为高端质谱产品的引领者,推出了LC-PASEF与MetsboScape结合的代谢组学通用解决方案,适用于代谢组学、脂质组学、表型组学、药物开发和环境暴露等多种不同的研究领域,并将继续开发扩充这一领域的应用和解决方案。