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4D-组学新时代!prm-PASEF引领靶向蛋白质组学新高度

来源:布鲁克 阅读数:74 时间:2020-12-16 14:35:18


离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D-Proteomics是在3D分离即保留时间(retention time)质荷比(m/z)离子强度(intensity)这三个维度的基础之上增加了第四个维度,离子淌度(mobility)的分离(图1),进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度,带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。


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图1. 新一代4D-蛋白质组学示意图

近期,4D-蛋白质组学技术方案又得到了完美补充,即将捕集离子淌度技术和PASEF采集技术与PRM技术结合,打造了全新的高通量和高灵敏的靶向蛋白质组学技术——prm-PASEF,至此,prm技术也全面进入了4D时代。 

4D-PRM方法应用的,通过在传统蛋白组学中引入第四个维度——离子淌度,突破过去靶向组学的最大限制,在不牺牲检测灵敏度、扫描速度及选择性且单针靶向离子数最大化的前提下,展现高度重现性及准确定量,带领靶向蛋白组学突破研究瓶颈、进入新高度。

平行反应监测技术(Parallel Reaction MonitoringPRM

PRM为一种高分辨、高精度靶向质谱技术,可用于蛋白组学相关研究如大队列样本中候选生物标志物的验证。相较于传统SRM,PRM的优势是单针方法中增加靶向肽段数量、谱图具有高度专一性及共隔离背景肽段的高耐受度。过去PRM最主要的技术限制在于单针靶向离子数、色谱分离时间及整体检测灵敏度间具补偿关系,因此,若需要大量靶向肽段数量的完整数据,必须增加色谱分离时间或牺牲质谱的灵敏度与选择性。
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图2:PRM示意图

prm-PASEF这种模式利用了TIMS进行第四维度分离,相对于普通的PRM提高了多肽离子的选择性和灵敏度,并结合了PASEF的高扫描速度从而增加了靶标离子的数量,实现更多、更快、更准确的靶向蛋白组检测,为靶向蛋白质组学在大队列中的应用带来无限可能。

prm-PASEF



更高的验证通量


布鲁克timsTOF Pro开发的prm-PASEF分析大幅增加靶向离子分析数目,可灵活搭配fast LC及UHPLC,且不损失检测灵敏度。得益于timsTOF Pro大于120Hz的MS/MS扫描速度,prm-PASEF理论上每100ms的TIMS ramp time可靶向大于12个目标离子,在1s的duty cycle时间内则可靶向超过100个目标离子,使得prm-PASEF能够在短时间内定量到更多蛋白。同时,PASEF快速的扫描能力能得到更多的数据采集点,产生专属性更高的MS/MS谱图,极大提高检测灵敏度和定量可靠性(图3)。

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图3. prm-PASEF采集Cycle示意图

在采用短梯度(30min)的prm-PASEF分析中,在单个prm-PASEF frame中,平均可监测4个靶向离子,而在每个prm-PASEF cycle中,平均可执行4个prm-PASEF frame,且不影响检测灵敏度及cycle time。在多母离子的情况下,每个MS cycle可涵盖高达10个frame,在短梯度的方法中,单个色谱峰可得到的数据点,经计算其中位数为25,并且在短短的30min内可以对216个目标离子进行监测(图4)。

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图4. (A)216个靶向窗口在保留时间及离子淌度维度的分布;(B)单个prm-PASEF中的靶向离子数;(C)单个prm-PASEF cycle中涵盖的prm-PASEF frame数;(D)单个色谱峰可取得的数据点数量。

prm-PASEF



更高的选择性


prm-PASEF的采集窗口包含色谱保留时间、离子淌度与四极杆隔离质荷比三个维度,在timsTOF Pro上,执行窗口重叠的母离子,在同一个prm-PASEF frame中,仍可以通过离子淌度此一维度进行分离,增加谱图专一性,当数个化合物在IMS及LC两维度中重叠,仍可经过连续的PASEF frames进行监测。
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图5. 具相同保留时间及离子淌度的共洗脱化合物在两个prm-PASEF frame中的分布

prm-PASEF因为有离子淌度的分离,在数据分析时,可以通过离子淌度这个维度对离子进行过滤,如图6所示,经过离子过滤窗口的打开可以显著降低目标离子的背景,从而提高离子的选择性和检测灵敏度。

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图6. 离子淌度过滤窗口可显著降低目标离子的背景


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prm-PASEF技术在100ms的内可以完成超过10个目标离子的监测,使其成为扫描速度最快、同步监测离子通道最多的PRM技术,在其高速的采集模式下,依然可以达到非常高的灵敏度。
在100 ng/uL Hela digest中加入201条重标肽及15条轻标肽,对其中15对轻/重标肽按进行系列稀释,浓度范围5.5amol/uL-50,000amol/uL,其余重标肽以2 fmol/uL的浓度加入样本,prm-PASEF实验中色谱、质谱参数如图7B及7C所示。
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图7. prm-PASEF实验设计

实验结果显示,在30min的液相梯度时间内,可对216个母离子靶向定量,以肽段ATVVYQGER为例,其最低定量限达到了17.2amole,且具有很好的重复性,在所有的浓度点,峰面积的RSD在±20%。
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图8. 肽段ATVVYQGER采用prm-PASEF定量结果


布鲁克全面利用timsTOF Pro捕集离子淌度技术高灵敏度及扫描速度的优势,发展prm-PASEF方法,具有高灵敏度、扫描速度、选择性等优势,并在高靶向离子数与短色谱梯度的应用下展现高度重现性及精准定量,这解决了传统PRM面临的挑战,必将促进靶向蛋白质组学技术在生物标志物的验证和临床转化方面的应用。


参考文献:
  • ·Bruker application note 1881734: prm-PASEF®: enabling high-throughput, high sensitivity targeted proteomics (点击“阅读原文”查看)

  • ·Antoine Lesur, et al., New prm-PASEF for highly multiplexed targeted acquisition inclinical samples,ASMS 2020 TP 470.

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  • ·Florian Meier, et al., Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer, Molecular & Cellular Proteomics,2018, 17, 2534–2545