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基于RNA干扰的免疫检查点纳米阻断剂:可实现不依赖于T细胞的癌症治疗

来源:分析化学 阅读数:129 时间:2020-12-15 16:11:20

背景介绍

    免疫检查点抑制剂被认为是对抗晚期癌症最有力的武器之一,它是通过阻断免疫抑制通路,增强宿主的免疫防御能力来杀伤肿瘤细胞的一种新兴抗肿瘤方法。然而,由于患者的个体差异以及传统基于抗体的检查点阻断疗法固有的缺陷,持续的临床治疗效益仅在少数患者身上得以体现。实际上,免疫检查点疗法的效果很大程度上取决于肿瘤组织周围杀伤肿瘤T细胞的数量。但是,近年来的研究表明大多数募集或浸润的T细胞(>90%)是不能识别和杀死周围肿瘤细胞的“旁观者”T细胞。一些癌症患者体内甚至没有肿瘤浸润性T细胞。此外,检查点阻断抗体只能阻断细胞膜上的免疫检查点,而细胞内部在不断地表达免疫检查点,并由细胞质转运到细胞膜上,大大地削弱了抗体类检查点阻断疗法的效果。其次,检查点阻断抗体甚至可以攻击那些没有处于适当激活状态的T细胞,诱导对进一步免疫治疗的抵抗作用,最终导致治疗的失败。

    近日,湖南大学谭蔚泓院士、刘艳岚教授等人开发了一种基于RNA干扰(RNAi)的肿瘤靶向免疫检查点纳米阻断剂,能够高效地敲低肿瘤组织中免疫检查点PD-L1的表达,并且以不依赖于T细胞的方式,直接诱导非小细胞肺癌细胞系H460发生程序性细胞死亡。

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成果简介

    在此研究中,研究人员利用马来酰亚胺-硫醇反应将肿瘤归巢肽CREKA与马来酰亚胺修饰的两亲性分支聚合物(PBPC)进行偶联,并通过与脂质/siRNA复合物的自组装,成功构建了肿瘤靶向型免疫检查点PD-L1的纳米阻断剂。所制得的纳米阻断剂可通过表面CREKA特异性识别肿瘤中血浆蛋白(例如,纤维蛋白-纤连蛋白复合物)网状结构富集在肿瘤部分。被肿瘤细胞摄取后,所负载的PD-L1靶向的小干扰RNA(siRNA)被释放,高效  沉默肿瘤细胞内PD-L1的表达,从而实现肿瘤靶向的免疫检查点治疗。

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图1.(A)基于RNAi的检查点纳米阻断剂的合成示意图;(B,C)基于RNAi的纳米阻断剂的TEM/AFM成像和DLS分析;(D)凝胶电泳分析游离siRNA和siRNA负载的PBPC NPs(靶向siNPs)的血清稳定性,siRNA标记有Cy5;(E)具有(靶向siNPs)与没有(非靶向siNPs)修饰的肿瘤归巢肽的纳米阻断剂的ζ电势。

    体外系列表征实验表明所构建的肿瘤靶向纳米阻断剂平均粒径在100nm左右,且在生理条件下具有良好的稳定性,无明显的聚集和siRNA泄漏现象的发生。

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图2.(A)GFP-A549细胞与负载有Cy5-siRNA的非靶向NPs与靶向NPs孵育6 h的共聚焦荧光成像;(B)在孵育2小时和6小时后,对这两个NP的细胞结合的相应流式细胞术分析;(C)用PBS,负载5nM siGFP RNA的PBPC NP(NC),siPD-L1的BP NP(NT)和siPD-L1的PBNP NP(T)处理48小时后的H460细胞的免疫荧光成像;(D)在5nM Cy5-siRNA负载的PBPC NPs与H460细胞孵育4小时后的内涵体逃逸分析。

    作者首先通过流式细胞术分析和共聚焦荧光成像考察了纳米阻断剂的细胞摄取、内涵体逃逸能力及基因沉默效率,上述结果表明纳米阻断剂具有良好的肿瘤细胞靶向能力及较高的基因敲除效率。

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图3.(A–D)用(A)PBS,(B)载有siGFP的PBPC NP(NC),(C)载有siPD-L1的BP NP(NT),(D)负载siPD-L1的PBPC NP(T)处理后,H460细胞凋亡的流式细胞仪测量siRNA剂量为5 nM, 转染时间为48小时;(E)在5nM的siRNA剂量下,这四个组的H460细胞中STAT3和p-STAT3的蛋白质印迹分析。(F)与PD-L1沉默诱导H460细胞死亡相关的分子机制。

    有趣的是,作者发现在PD-L1高表达的H460细胞中,通过利用该RNAi型纳米阻断剂敲除PD-L1后,在没有T细胞的存在下,H460细胞发生显著的细胞凋亡,且细胞增殖和侵袭能力也受到了大幅度抑制。

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图4.(A)PBS,负载siGFP的PBPC NP(NC),负载siPD-L1的BP NP(NT)和负载siPD-L1的PBPC NP(T)处理的H460细胞的增殖曲线,siRNA剂量为5或10 nM;(B)在治疗后第8天,这些组细胞中PD-L1的表达;(C)siRNA剂量为5 nM的H460细胞伤口愈合试验的代表性图像和(D)定量分析,比例尺为100μm;(E)细胞侵袭实验的示意图;(F,G)在5 nM siRNA剂量下,不同处理组H460细胞的迁移和定量分析,比例尺为100μm。

    作者进一步探究了该RNAi型纳米阻断剂的抗肿瘤机制,结果表明PD-L1的沉默,显著抑制了H460细胞内STAT3的磷酸化,并且激活了caspase的活性,从而诱导了细胞凋亡。

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图5.(A)体内治疗策略示意图(B)用PBS,负载siGFP的PBPC NP(NC),负载siPD-L1的BP NP(NT)和负载siPD-L1的PBPC NP(T)的体内PDL1沉默效果;(C)PD-L1,Ki67和TUNEL的IHC染色,以及来自这四个组的肿瘤组织切片的H&E染色;(D,E)不同处理组的H460异种植瘤小鼠的肿瘤组织和不同组处理的小鼠肿瘤生长趋势(n=5)。

    在H460细胞移植瘤模型中,所构建的RNAi型PD-L1纳米阻断剂能够显著敲低肿瘤组织内PDL1的表达,并且能够有效抑制肿瘤的生长,同时没有引起明显的毒副作用。所有实验结果表明基于RNAi的PD-L1纳米阻断剂有望成为一种高效且安全的NSCLC治疗策略。

总结

    作者提出了一种基于RNAi纳米技术介导的新型免疫检查点阻断策略。这种RNAi驱动的检查点纳米阻断剂有望克服传统抗体型检查点抑制剂在癌症治疗中所面临的挑战,如阻断效率低、系统免疫副作用等。这种策略使得T细胞非依赖性癌症治疗成为可能,同时,该工作也可为进一步理解免疫检查点功能及免疫疗法分子机制提供不同的视角。此外,我们仍需要对其深入的抗肿瘤分子机制及长期体内安全性做更深入的探索。总体而言,通过与其它免疫检查点抑制剂或治疗方法相结合,该策略有望大幅度提高抗肿瘤的效果,具有潜在的应用价值。


原文链接:

https://doi.org/10.1021/acsnano.0c08022

来源: 分子科学与生物医学实验室MBL