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工程化一种在细胞膜上感应后释放的二阶DNA逻辑门控纳米机器用于多通道的诊断和协同治疗

来源:分子科学与生物医学实验室MBL 阅读数:293 时间:2021-05-06 09:06:15

Dan Wang et al. Engineering a Second-Order DNA Logic-Gated Nanorobot to Sense-then-Release on Live Cell Membranes for Multiplexed Diagnosis and Synergistic Therapy.

Angew. Chem., 2021, DOI: 10.1002/anie.202103993

第一作者:王丹(男,湖南大学MBL在读博士)

通讯作者:谭蔚泓(湖南大学)


1.引言

近年来,基于肿瘤标志物的主动靶向诊疗策略取得了极大的进步。然而,肿瘤标志物在肿瘤细胞中非排他性表达的现象常常导致诊疗试剂“在靶,非肿瘤”的脱靶问题,从而产生假阳性和毒副作用。基于逻辑运算识别肿瘤细胞表面多个疾病标志物的DNA纳米机器为肿瘤细胞的精准识别提供了一种有效工具。然而,目前大多数DNA纳米器件存在以下亟需解决的关键问题:(1)难以满足生理条件下原位操作要求。例如,37°C长时间孵育往往会导致DNA纳米器件的非特异性内化和泄漏。(2)难以从三到四种相似的亚群或亚型细胞中实现单次输入即识别目标细胞。(3)难以实现“one cell one barcode”的诊断和针对目标细胞的协同杀伤。

鉴于此,谭蔚泓院士课题组构建了活细胞膜锚定的二阶DNA逻辑门控纳米机器人(DLGN),同时实现多路诊断和靶细胞的协同杀灭。该纳米机器人能在半小时内区分5种实体瘤细胞(或正常细胞),特别是乳腺癌的肿瘤进展情况;能在6h内出现明显的靶向杀伤效果。

2.设计原理&特点

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图1. DLGN的分子设计和运行原理。(a)基于多种适配体介导的感应后释放策略的一般分子设计,用于精确细胞鉴别和靶向杀伤。表达不同标记物的不同细胞通过DLGN的识别和释放将会被相应的荧光条形码标记。(b)DLGN在靶细胞膜上执行二阶逻辑生物运算后产生的级联生物事件。


我们构建的DLGN是报道以来最具备“人类”特征的DNA纳米机器人(图1a)。头部(EASDs)是执行运算和做出治疗决定的部位,由效应部件组成;躯干由稳定的DNA四面体支架组成;两只脚是DNA机器人识别单元,由被部分互补链杂交的核酸适配体组成;三只手臂是定向组件,用于支撑DNA纳米机器人长时间锚定于细胞膜,防止内在化,由大体积、负电性链霉亲和素SA组成。该分子设计的特点和应用如下:1)识别组件:MUC1和EpCAM的核酸适配体分别修饰上FAM和Cy3荧光链,其互补链修饰对应的猝灭链BHQ1和BHQ2。在识别相关靶标后产生相应荧光。2)效应组件:只有当两个识别组件释放出互补链之后,Cy5修饰的EASDs受到链置换的驱动而掉落,恢复荧光(图1b),之后遭遇到靶标PTK7后,触发二次逻辑运算,进入并靶细胞,在GSH响应下发挥协同治疗作用(化疗药物CA4和PTX);3)定向组件:在此修饰的负电的大体积的SA,助于定向停泊在细胞膜表面而极少内化,以避免引起假阳性信号; 4)面向自主的多路成像和协同治疗应用:对表达相应标记物的五种细胞确立多种逻辑门致动的细胞自动化识别,并成功进行多通道成像,并对唯一的靶细胞(MDA-MB-468)进行有效的协同药物杀伤。

3.图文数据

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图2. DLGN的构建和表征。(a) AGE荧光凝胶电泳实验证明SA标记的DLGN的成功组装。(b) 四面体支架DTS和纳米机器人DLGN的DLS粒径分布。(c) SA修饰的DTS,胆固醇修饰的DTS和无标签修饰的DTS对靶细胞MDA-MB-468和正常细胞MCF-10A的成像。


该实验发现SA-DTS不会内化到细胞内,只会依赖于适配体的识别“停泊”在细胞膜上,而chol-DTS和free-DTS则会出现非特异性的锚定和无选择性的内化。证明SA特殊修饰下的DNA纳米机器人更适合做细胞表面的识别和生物计算。


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图3. 流式细胞仪检测5种细胞系8个相应适配体的细胞表面蛋白谱。(a) MCF-10A(正常乳腺细胞),MCF-7(急性的乳腺癌细胞),MDA-MB-468(转移性的三阴性乳腺癌细胞),Hela(宫颈癌细胞)和HepG2(肝癌细胞)在8种FAM修饰的核酸适配体孵育后的荧光强度热图。(b) 选取的三种生物标记物(和对应的核酸适配体)在5种细胞系的表达情况。


该实验为DLGN的链设计提供具体的模型指导, 即:两个脚趾分别采用MUC1和EpCAM的适配体,效应头部拟用PTK7对应的适配体Sgc8c。



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图4.在缓冲液中对DLGN “AND”布尔逻辑门运算的可行性测试。(a)DLGN在脚趾适配体的互补解码链(cM*和cE*)的置换下引发的荧光恢复情况示意图。(b) DLGN在解码链孵育下的荧光测试谱图。


实验表明当两个解码链共同存在时才会触发Cy5-EASDs的荧光恢复,证明了“AND”布尔逻辑门运算的可行性。


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图5. 多路诊断识别五种细胞系和精确协同杀伤靶肿瘤细胞。(a) 点击化学下的协同药物EASDs的合成。(b)标记物构成的布尔逻辑门网络驱动5种细胞的多通道成像和识别。(c) 基于流式细胞术的五种细胞系相对荧光强度的热图分析。(每个小格从左下往右上依次是MCF-10A, HeLa, HepG2, MCF-7, MDA-MB-468)。蓝色表示没有荧光输出,红色表示有荧光输出。圆圈的面积表示相对的荧光值大小。实现表明每种细胞有相应的条形码输出(右图)(d)不同药物处理6h后,5种细胞的存活情况。


该DLGN药物仅靶细胞MDA-MB-468有杀伤毒性,而EASDs对PTK7高表达的Hela和HepG2的“旁观者“细胞有细胞毒性。相比于单种药物分子CA4-DLGN和PTX-DLGN, 多负载的DLGN具有对靶细胞更高的杀灭效果。


总结与展望

本工作构建了一种智能DNA分子机器人,其只需要一次输入这一种分子即可自主完成多种肿瘤细胞的分型,以及对某一特定肿瘤细胞的协同药物杀伤。DLGN可以在半小时内区分多种相似的细胞系,并在6小时内的原位血清中杀死靶肿瘤细胞,消除靶抗原脱靶现象。此外,通用的“感知然后释放”策略也能够功能化其他标记物 (如HER-2或EGFR) 到这个二阶逻辑门控DNA纳米机器人上。可以想象,这种合理设计的DLGN纳米机器人的脚趾、躯干, 手臂和头部,可以激发其他更智能的DNA纳米机器人工程,以及在分子开关、多模式传感器、可控的捕获-释放、精准的分子医学和其他基础研究和临床测试方面的更广泛应用。