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李昌厚:HPLC部分应用中的最新进展及有关问题

来源:分析化学 阅读数:310 时间:2020-04-28 09:35:55

最近几年,HPLC的应用发展很快,各行各业对HPLC的需求量猛增;我国HPLC的年需求量达20000台,其中中高档的HPLC年需求量约10000台以上,全球需求量约55亿美元以上。很多原来用紫外光谱仪器分析检测的工作,都因为HPLC具有高速度、高分离效率、高灵敏度的特点,而纷纷改为用HPLC分析检测。目前,HPLC在食品、药品、环保、农业、工业等领域的科研、生产、质量控制等方面被广泛应用,具有广阔的应应用前景。



一、HPLC部分应用进展


由于HPLC采用先进的检测技术和分析方法,可对流动相、固定相进行调节或改变,采用梯度洗脱、柱切换等技术,特别是梯度洗脱的高效液相色谱法,能分析较宽极性范围的样品,较等度洗脱具有很大的优势;对于成分较复杂、极性范围更宽的样品,采用多柱高效液相色谱法或称多维高效液相色谱法也能解决有关分析检测问题。


HPLC法还可以改变固定相种类、键合度、粒径、柱长、柱径等,以及改变流动相种类、浓度等,再加自动化、智能化及联用技术上的发展,HPLC的应用在高效液相色-质谱联用、高效液相色谱-核磁共振联用、高效液相色谱-各类光谱联用等方面的应用也得到了大发展


最近流行的智能多柱高效液相色谱系统利用切换技术的模块式分离性能,把样品分块的切换进不同性质的色谱柱,再用合适的流动相洗脱,全过程采用智能化控制,应用效果非常好。


总体而言,HPLC近几年的应用进展很快,下面主要介绍近5年内,我国科技工作者在HPLC应用中取得的部分进展:


1、2019年,胡伟等报道:他们首次在国内提出,将HPLC(DAD检测器)与超声萃取联用技术应用到彩泥(造塑粘土)产品的分析检测工作中。他们用这种联用技术,建立了一种用HPLC同时检测彩泥制品中9种防腐剂(苯甲酸、苯甲醇、甲基异噻唑啉酮、对羟基苯甲酸甲脂、对羟基苯甲酸乙脂、对羟基苯甲酸丙脂、对羟基苯甲酸丁脂、对羟基苯甲酸异丙脂、和对羟基苯甲酸异丁脂)含量的检测方法。此类彩泥具有致敏性和致癌性,幼儿长期接触或误食,会对健康造成严重的影响。目前,国内没有对彩泥制品中防腐剂的类别和限量做出明确规定,建立控制彩泥中防腐剂的使用和用量,显得非常重要。胡伟等建立的对这9种防腐剂的检出限为5mg/kg~200mg/kg,回收率达到90.9%~106.9%,精密度和稳定性的相对标准偏差为0.89%~2.88%、0.54%~2.58%。该方法具有简便、快速、高效、灵敏度高等优点。


2、2019年,徐可等报道:他们研究了用HPLC外标法,测定盐酸二甲双胍片的含量。盐酸二甲双胍片是一种双胍类口服降血糖药物,用于不能单纯靠饮食控制的Ⅱ型糖尿病人。盐酸二甲双胍片的相关标准规定是采用紫外可见分光光度计测定含量,但是,受辅料影响测定的准确度差、精密度差。而徐可等人建立的HPLC外标法测定盐酸二甲双胍片的含量时,在色谱柱为AZE  C18(250mm×4.6mm,5µm);流动相为磷酸盐缓冲液:乙腈(90:10,V/V);检测波长:233nm;柱温:300C;流速:1.0mL/min;进样量:20µL的情况下,按3倍信噪比计算得到的检测限和按10倍信噪比计算得到的测定限各为0.45µg/mL、1.5µg/mL。该方法具有准确度高、重现性好等优点,并且有利于对测量的不确定度评定。


3、2016年,窦金凤等报道:他们用HPLC法同时测定健胃愈疡片中靛蓝和靛玉红的含量。靛蓝和靛玉红含有活性成分,具有明显的消炎、解毒的作用,原国家标准只能鉴别靛蓝和靛玉红是否存在(定性),窦金凤等人为了有效控制该药品的质量,建立了用HPLC法测定健胃愈疡片中靛蓝和靛玉红的含量(定量)的方法。该方法采用流动相为乙腈:水﹦60:40的最佳比例,在290nm的波长下,得到了最佳峰形和最佳柱效。回收率平均值可达到98.6%,RSD为0.8%。该方法进一步完善了测定健胃愈疡片中靛蓝和靛玉红的方法、可以准确测定靛蓝和靛玉红的含量,具有准确度高、稳定性好、可靠性好、简便等优点,为健胃愈疡片的质量控制提供了一种好方法。


4、2017年,北京市理化分析测试中心等的勾新磊等报道:苯并三唑类化合物:2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑(UV-P)、2-(2-羟基—3,-5-二枯基苯基)苯并三唑(UV-234)、2-(2-羟基-3-5-二叔丁基苯基)苯并三唑(UV-327)、2-(2-羟基-3,5-二叔戊基苯基)苯并三唑(UV-328)、2-(2-羟基-5-叔辛基苯基)苯并三唑(UV-329)等,具有一定的毒性,能引起皮肤过敏、引起皮炎,并且影响生物体的正常生长、影响塑料制品的使用寿命。目前的苯并三唑类化合物的检测方法虽说有其优点,但是其分辨率和准确度较低,只能适合对有标准品的化合物定性和定量分析,并且容易出现假阳性的检测结果。勾新磊等人建立了一种新方法,将HPLC-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用,对食品塑料包装袋中的5种苯并三唑类紫外吸收剂进行了快速筛查。采用正离子模式,通过提取一级质谱的精确相对分子质量进行定量,提取二级质谱进行定性,构建了5种苯并三唑类化合物数据库,可以在12分钟内完成筛选和定量工作。该方法用W.A.U.C18(100×2.1mm,1.7µm)色谱柱,甲醇和0.1%(V/V)甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,通过高分辨率质谱的全扫描/实时二级质谱扫描模式进行检测,得到准确的质量数和准确的碎片离子信息,构建了5种苯并三唑化合物的筛查数据库,并进行定性定量分析检测。该方法具有快速、准确、可靠性好、重现性好、选择性好等特点,能满足食品塑料包装袋中5种苯并三唑类化合物的快速筛选与定量分析检测。该方法是HPLC在检测苯并三唑类化合物应用领域中的一种有效的新方法,在食品工业中有广泛的前景。


5、2018年,北京市理化分析测试中心等的王尉等报道:他们采用HPLC测定了苜宿根系样品中脱落酸(ABA)的含量。苜宿(Medicago  satiua)是多年生豆科草本植物,因其具有高产、营养丰富等优点,被誉为“牧草之王”。BAB可作为植物抗旱能力重要的调节因子,对植物的细胞分裂与生长、组织与器官的分化、休眠与萌芽、植物形态建成等等具有重要作用。通过分析ABA在植物体内分布的含量变化规律,研究它与抗逆能力的关系,将为合理、有效地配比外源激素,提高植物的抗逆性、培育出耐旱植物的新品种提供理论依据。因此,建立用HPLC快速准确的苜宿中ABA的分析方法具有重要的应用意义和实用价值。王尉等人建立的HPLC检测苜宿根系样品中脱落酸的方法,为测定苜宿根系样品中脱落酸(ABA)的提供了一种新方法。该方法具有快速、简便、重现性好、准确度高的优点,在ABA含量测定时,样品在0.05~1mg/L范围内具有良好的线性,检出限0.02µg/g、定量限为0.04µg/g,可以广泛应用于植物中ABA含量的测定。


6、2018年,王韦岗报道:他们建立了固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量及条件优化的方法。克伦特罗是一种激素类物质,俗称“瘦肉精”,该物质能促进动物体内脂肪分解代谢,增加蛋白质合成,提高瘦肉率,但是人体食用高残留量的内脏组织或累计摄入量超过一定值时便可能引发食物中毒。现有对蜂蜜中克伦特罗残留量检测的方法还不够完善,王韦岗建立了固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量的方法,该方法在HPLC检测器的波长为210nm的条件下,检测到克伦特罗的含量为0.10~1.00µg/mL,为蜂蜜中克伦特罗残留量的检测提供了一种新的方法。


7、2019年,杨华等报道,5-三磷酸腺苷(ATP)是肌肉收缩的唯一直接能量来源,是生物体组织维持正常生命活动所必须的能量物质,二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)是引起疲劳的重要因素之一,可以说  ATP、ADP、AMP与生命活动息息相关。目前,国内对ATP、ADP、AMP给出了各种检测标准,但是这些标准有不尽人意之处,例如:损害色谱柱、对复杂体系很难分离、重现性差等等。因此,杨华等在国内首次用HPLC比对法,试图通过色谱柱、缓冲液、柱温等条件的改变,研究了ATP、ADP、AMP的检测。其结果是:在室温条件下,采用symmetryshield  RP18(4.6,250mm,5µ)的色谱柱,缓冲盐浓度在0.05mol/L,PH5.85时,ATP、ADP、AMP能够和样品中的杂质很好的分离,分离度分别为1.5477、1.6459、3.855,该结果令人满意。


8、2019年,杨璐等报道:国家标准GB/T25277-2010规定的HPLC检测塑料中的芥酸酰胺,检测灵敏度低。他们在国内首次研究用HPLC内标法,在色谱柱为C18,5µm,150mm×4.6mm;流动相为乙腈:水=95:5;流速1mL/min;波长为202nm的情况下,检测薄膜中的芥酸酰胺的含量,得到了满意的结果,检出限0.2mg/L,定量限1mg/L,具有较好的稳定性和灵敏度。通过比对几个芥酸酰胺检测标准,他们还发现了我国有关标准重复交叉的情况。这一应用研究,既是HPLC应用的最新进展,又对我国发展包容性更强的NPLC质量安全检测检验标准具有重要意义。


9、张朝辉等报道:托吡脂具有抗神经兴奋和抗惊厥作用,主要用于抗癫痫和偏头痛的治疗。该药物口服生物利用度高达80%,因此,定量研究托吡脂及其代谢物显得尤为重要。托吡脂及其代谢物常用的分析检测方法为HPLC,但是该方法需要衍生化,存在操作繁琐、定量下限高的缺点。张朝辉等用高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS),对血样中托吡脂及主要代谢物2,3-二羟基托吡酯,4,5-二羟基托吡酯,进行一级质谱和二级质谱分析检测,首次建立了快速、高效、检测限低的多反应质谱检测(MRM)分析方法。该方法成功应用于服用托吡脂联合苯妥英钠等其它药物的癫痫患者,同时可以准确地进行托吡脂及代谢物的血药浓度监测,为医学样品分析提供了一种新的采用HPLC检测的方法。


由于HPLC具有高速度、高分离效果、高灵敏度等优点,目前几乎所有需要分离的大分子(分子量大于300以上)有机物的分析工作,它都可以发挥优势,因此HPLC的应用发展也非常快。由于篇幅所限,本文不能更多的介绍,但是,可以预言,HPLC的应用,将在“农、轻、重、海、陆、空,吃、穿、用”等各个领域、各行各业无所不在、无所不有,非常值得重视。



二、几个有关问题


1、要打破崇洋媚外的思想、大胆使用能满足使用要求的国产HPLC


目前,我国上海伍丰公司、浙江福立公司等都能生产UHPLC,质量都能满足使用要求,性价比大大优于进口产品。特别是上海通微公司推出的高效微流电色谱(国家“十二五”的重大仪器专项),其性能指标、性价比都优于进口的UHPLC。


但是,国人就是要花大价钱去买进口UHPLC,实在是令人费解。在我国的政府招标过程中,国产HPLC多次中标战胜国外品牌的例子很多,例如:对三聚氰胺建立国标时,招标过程中,在难以决定取舍的情况下,采用比对测试方法,结果国产HPLC仪器的测试数据非常优异,一举战胜国外名牌公司的产品。专家们根据比对检测数据的准确性、仪器的性价比等评价仪器的标准,一致通过采用北京普析通用公司的L6(目前升级为L600),作为三聚氰胺建立国家标准的仪器。


此间,国产HPLC打败了两家国外名牌公司的进口产品,成为我国三聚氰胺国家标准中推荐的唯一国产HPLC仪器。作者认为,我国国产的HPLC基本上都能满足使用要求。我们中国的科技工作者应该从民族高度看国产仪器和进口仪器。要大胆使用能满足使用要求的国产仪器(但是有极少数仪器离真正能满足使用要求还有差距,使用者在购买HPLC时应该高度重视之)。


我们千万不能盲目迷信外国产品,当然盲目排外也是不对的,目前我国还不能生产的仪器,特别是有些高端HPLC,我们还是应该进口,并且一定要消化、吸收,为我所用。我们应该大胆的以质量取胜,让国产品牌的HPLC与进口HPLC在中国的市场上“共舞”,逐步让国产HPLC占领我国主市场。


2、关于中国HPLC仪器和应用创新的切入点


作为一个年长的科技工作者,以作者多年研发和使用HPLC的经验和教训,作者认为,目前我国的HPLC生产企业和应用领域,还应该加强技术上的创新、打破陈旧的思维、跳出常规的束缚、并大胆的创新。


目前我国已经有不少企业生产HPLC仪器,但是,我国HPLC的主市场仍被外商占领,这是反常的现象。究其因,作者认为主要问题是HPLC仪器生产企业中,有不少人致力于模仿国外的产品,跟在洋人后面研发、生产HPLC,同时国内同行之间经常在搞低水平的重复。


而在HPLC应用方面,使用者缺乏大胆创新精神,总是从文献来到文献去,迷信洋人的工作,特别是在分析方法创新、分析条件选择创新方面,更是存在缩手缩脚的问题等。上述这些问题,可能是我国HPLC仪器和应用进展不尽人意的主要原因之一。


作者认为只是模仿、只是跟在洋人后面墨守成规,是永远没有出路的。因此,建议广大HPLC仪器研发、生产者应该大胆走出去,到广大用户中去,以用户的需求作为创新的出发点或切入点,这才是正确的思路。


同时,我国的HPLC生产企业还应该进一步加强质量观念,努力提高产品质量、提高可靠性,以优异的质量赢得广大使用者的信任、去占领市场。在应用方面,广大使用者在HPLC的仪器和应用方面不应该当局外人,而应该是积极主动的参与者。


广大分析检测工作者应该主动向有关的HPLC研发、生产者提出自己的需求,主动指出产品的问题,让研发、生产者知道使用者的要求和自己产品的问题,从而研发、生产出更多更好的优质HPLC。总之,HPLC的制造者、使用者都应该大胆创新,大家共同努力为国产HPLC赶超国际先进水平而奋斗


3、牢记HPLC使用者的初心和使命


广大科技工作者使用HPLC的初心和使命是什么?作者认为应该是“用好”HPLC。所谓“用好”HPLC,就是认真选择仪器条件,将HPLC用到最佳条件下、得到最佳分析测试数据(即得到分析检测误差最小的数据)。


而要“用好”HPLC,就必须了解一些仪器学理论必须将仪器学、分析化学有机的紧密结合起来思考问题;要认真学习,搞清楚HPLC仪器的性能指标的物理意义,这些指标对分析误差的影响,使用者如何简单的检查HPLC的主要性能技术指标是否处在最佳状态;同时,要认真做好样品前处理,尽量排除各种干扰。只有这样,才能得到最佳分析检测数据,才能得到分析误差最小的分析检测结果,这才是分析检测工作者的初心和使命。


目前,国际上的科学家们一致公认,HPLC应用中的主要分析误差来源有五个方面:第一,样品前处理,它带来的分析误差占总分析误差的30%;第二,仪器的性能指标,它带来的分析误差占总分析误差的35%;第三,仪器条件的选择和正确的操作方法,它带来的分析误差占总分析误差的30%;第四,所用的分析方法或仪器的原理,它产生的误差(例如:光吸收类的仪器,因为非平行光产生的误差、数据处理方法等带来的分析误差等)约占总分析检测误差的2%;第五,环境的影响,它产生的误差约占总分析检测误差的3%。


这五个方面,是分析检测工作者必须要注意和重视的关键问题。只有这样,才能保证HPLC使用者不忘分析检测工作者的初心和使命。





作者简介

李昌厚,男,中国科学院上海生物工程研究中心原仪器分析室主任、兼生命科学仪器及其应用研究室主任、教授、博士生导师、华东理工大学兼职教授,终身享受国务院政府特殊津贴。

主要研究方向:分析仪器及其应用研究。长期从事光谱仪器(紫外吸收光谱、原子吸收光谱、旋光光谱、分子荧光光谱、原子荧光、拉曼光谱等)、色谱仪器(液相色谱、气相色谱等)及其应用研究,特别对《仪器学理论》等有精深研究;以第一完成者身份,完成科研成果15项。由中科院组织专家鉴定,其中13项达到鉴定时国际上同类仪器的先进水平,2项填补国内空白;以第一完成者身份获得国家级和省部级科技成果奖5项(含国家发明奖1项);发表论文183篇,出版专著5本;现任中国仪器仪表学会理事、《生命科学仪器》副主编;曾任中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届、第六届副理事长;国家认监委计量认证/审查认可国家级常任评审员、国家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大仪器及其应用专项的技术专家组成员或组长、上海市科学仪器专家组成员、《光学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编等十多个学术团体的领导职务和专家委员会成员等。

来源:仪器信息网