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CHO-K1 细胞培养制备单抗的策略和 HCP 残留的检测方法

来源:Cytiva思拓凡 阅读数:220 时间:2020-04-28 09:16:39

摘  要

单克隆抗体在生物制品中占了绝大多数,如何提升生产效率及提供高质量的产品是目前的主要课题。培养基和补料策略会大大影响细胞活率和蛋白产量,可从细胞株筛选、工艺设计及使用何种培养基来优化细胞培养和生产策略。


在产品质量方面,宿主细胞残留蛋白(HCP)是关键质量属性之一,最终产品的 HCP 含量需低于法规单位要求,准确检测 HCP 的含量是生产时的关键步骤。CHO-K1 是常用于生产的 CHO 细胞系之一,本文以 CHO-K1 为主,讨论其细胞培养策略及其 HCP 检测方法。


01

背景介绍 


自 1980 年代以来,单克隆抗体开始运用于各种临床疾病治疗,包括类风湿性关节炎,多发性硬化症和各种癌症。目前单抗药物的全球销售额超过 1,020 亿美元,约占全球生物制药销售额的 48%,证明了单克隆抗体疗法的成功。


由于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及其衍生的细胞系在细胞培养中的高生产率和耐用性,已经被业界广泛应用于单抗生产。为了满足单抗的市场需求,目前行业的主要研究在于如何优化细胞培养,以提高单抗的产量,包括优化培养基的补料策略,克隆的选择方法以及建立细胞系工程技术,使产量能超过 10 g/L。CHO 细胞包含多种谱系,例如 CHO-DXB11(或 DUKX)、CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S。它们具有相同的祖先。


1956 年

最初的 CHO 细胞系由 Theodore Puck 博士于 1956 年建立,CHO-K1 源自 1957 年的原始细胞系亚克隆。

1980 年

CHO‐DXB11(或 DUKX)从 CHO‐K1 的化学诱变产生。

1983 年

Urlaub 等人删除了两个二氢叶酸还原酶(dhfr)等位基因,从而产生了 CHO-DG44。

1991 年

CHO-S 细胞系由另一个 CHO 细胞起始种群产生。目前所有这些细胞系都被广泛用于生产生物药物。


02

培养基开发策略 


2.1

细胞株筛选


由于需要大量工作来开发培养基,大多数生物制品制造商倾向于开发一套互补的平台细胞系和培养基生产蛋白质。但是,有些制造商会拥有多种细胞系系统以因应不同的需求(例如单克隆抗体和双特异性抗体)。在这种情况下,可能需要为不同的细胞系/模式系统开发单独的培养基。


选择模型细胞系和制备冷冻研究细胞库,以最大程度地减少可能与培养基开发过程中的传代培养相关的变异性。要开发适用于多种细胞系的培养基,模型细胞应当使用表达不同分子的细胞系或表达同一分子但产量不同的不同细胞系。这种策略是要解决不同细胞系统之间潜在的多样化培养差异,以确保新开发的培养基能够支持多种细胞系。


开发的培养基首先应支持细胞繁殖(seed train)。在细胞株开发期间,表达蛋白质的细胞系通常在先前内部开发的培养基或市售培养基中扩增。为了最大程度地减少细胞对工艺开发和生产中使用的培养基的额外适应,建议在工艺开发时使用和细胞株开发时相同的培养基。如果细胞株开发时的培养基不同于工艺开发或生产用的培养基,则细胞倍增时间,生长速率和细胞系稳定性需具有可比性,随后的优化如要提高培养性能和生产率,则必须进行培养基分析以平衡培养基的营养物水平,以最大化细胞的生长和生产力,同时减少有毒代谢物的积累并最大程度地减少营养消耗。


2.2

设计与优化


DoE 方法已广泛用于培养基成分筛选和配方优化。对于大多数进行成分筛选的实验室,常用的方法是利用 DoE(例如因子分解,Plackett-Burman 解析度或针对多种成分的确定性设计),然后通过反应曲面设计来缩小最佳浓度范围。要监测的实验参数包括细胞生长,例如细胞倍增时间或生长速率的变化,细胞直径,生产产量或特定生产率,葡萄糖,乳酸,氨,氨基酸水平的代谢变化以及糖基化,电荷等产品质量属性异质性和汇总级别。


与细胞生长有关的参数可作为种子培养效率的指标。细胞直径的测量提供了细胞周期状态的形成以及脂质和膜相关蛋白的组成以及细胞内细胞器(即内质网,高尔基体和囊泡运输)和细胞膜中的分布。生产率的测量将培养的生产状态联系起来。代谢物分析显示了养分利用率的高低。产品质量评估给出了在测试条件下生产的最终结果。大多数实验室都配备了适当的仪器来支持这些分析。通过成分调整和实验评估(包括化学计量的养分平衡)进行迭代配方修改,产生可行的培养基配方(图 1)。




图1. 培养基开发流程图


2.3

生产工艺考量


细胞系和生产工艺决定着培养基开发战略。为了适应多种生产工艺,例如流加批次和连续灌流,必须使用多种不同的培养基。为了支持这种多过程策略,其中一种方法是开发不同的培养基模块以支持工艺中的特定要求。一旦开发了培养基模块,就可以灵活地应用它们以支持个性化的流程需求。对于后期工艺开发,可以将模块合并到最佳级别,以用于商业制造设施的单个或更少的批量供应。


对于传统的流加批次生产工艺,通常使用两类培养基,基础培养基和补料培养基。葡萄糖通常根据需要单独添加,并保持在培养持续时间的目标范围内。基础和补料培养基配方的组成设计为互补的。


在生物反应器中,基础培养基用于从细胞复苏、接种,及细胞种子扩大培养,其成分组成通常比其补料培养基更稀薄。因为基础培养基的目的是维持细胞生长速率,培养倍增时间和高细胞活力,并维持细胞传代性能以及在细胞繁殖过程中产生最少的有毒代谢产物(如乳酸和氨)的能力。


基础培养基的重量克分子渗透压浓度通常为 270-330 mOsm/kg。而补料培养基是用于支持最终种子生物反应器(N-1)和生产(N)生物反应器中更高的细胞密度和生产率。补料培养基的营养通常比较富集,且渗透压比较(> 900 mOsm/kg)高。连续灌流工艺可以运行数月,在整个过程中定期或连续进行产品回收。


支持这种生产策略的培养基必须具有与用于种子细胞扩增的基础培养基相似的成分,并在补料批次生产中使用的补料培养基中增加关键成分的离子,以确保维持高细胞密度和提高细胞生产力。


不同细胞培养基和补料策略也会影响抗体生产工艺及产量。利用生产相同抗体的 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 细胞系在 ActiPro(GE HyClone)and Media A 培养基中,使用特定浓缩补料进行 fed-batch 培养,实验材料和补料策略如图 2 所示。




图 2.  实验准备材料(A)和 Fed-batch 补料方案(B)


实验结果显示当 ActiPro 用作三种重组细胞系(CHO-K1,CHO-DG44 和 CHO-S)的基础培养基时,可获得最高的细胞密度和抗体浓度(图 3)。ActiPro 中较高的比生长速率带来较高的细胞峰密度和活细胞积分(高达五倍差异)。两种培养基中细胞生长比较发现 IgG 浓度可达六倍的差异(图 3B)。ActiPro 在 fed-batch 模式中较高的活细胞积分是获得更高抗体浓度的主要原因。




图 3. 细胞密度曲线 (A) 和抗体浓度曲线 (B)


本实验中两种 fed-batch 策略明显影响细胞代谢速率,包括营养物质消耗和副产物形成。培养于 Medium A 中时,三种细胞系的葡萄糖消耗率均高达 30-55%,而且具有细胞特异性。同时三种细胞系葡萄糖转化为乳酸的比例也具有明显差异, 其中 CHO-S 细胞最低,约为 10-15%,CHO-DG44 细胞 为 25%, CHO-K1 细胞中葡萄糖转化为乳酸的比例最高,可达 40%。


谷氨酰胺是 CHO 细胞的主要能量来源,谷氨酰胺消耗为高度宿主细胞特异性,同种细胞系在两种培养基中消耗比例大致相同。三种细胞系在 Media A fed-batch 培养中谷氨酰胺均为净消耗,而在 ActiPro 培养物中则观察到净生成,这一发现可能会影响未来补料策略的设计。两种培养基中,CHO-K1 细胞系氨生成率保持不变,而在 CHO-S 和 CHODG44 细胞系中,ActiPro 相比 Media A 氨生成率低 30-60%。


不同培养基间细胞峰值密度有 5 倍差别,抗体滴度高达 6 倍差别。细胞代谢速率(例如葡萄糖和谷氨酸)也受培养基的影响,乳酸生产及谷氨酰胺消耗(均有细胞特异性)主要取决于 CHO 细胞系。对于产品质量,培养基和 CHO 宿主细胞系的选择均可用于微调抗体糖基化,例如岩藻糖基化,半乳糖基化和甘露糖基化等。


在抗体质量方面,所有样品在 SDS-PAGE 上是均一,纯度高且具有正确的分子量,通过 SEC 测定,聚集体小于 5%。高岩藻糖化出现在 CHO-S 细胞系及 Media A 培养基中,CHO-S 和 CHO-K1 细胞系培养于 ActiPro 生产的抗体有更高水平的半乳糖化,甘露糖结构在 CHO-S 中被最有效地加工(最低的高甘露糖结构),然后是 CHOK1 和 CHO-DG44。显示抗体 的糖基化变化与 CHO 细胞系的使用以及补料策略有关。


03

无血清培养基开发


目前生物药工艺对于使用血清的安全性和成本问题日趋重视,已有许多使用无动物成分来源的培养基(如无血清培养基)已经商业化生产或正在开发中。这种类型的培养基配方可以在无血清的情况下维持细胞生长和产率,同时这些配方可以通过优化而改善细胞的生长并增加单抗分子的比产率。一项针对七种无血清培养基对 CHO-K1 细胞株的细胞密度和蛋白产量测试中发现 CDM4CHO 培养基表现出高水平的细胞密度和单抗产量,更为突出的是随着培养时间增加会有提高的趋势。


所测试的培养基包括:

  • EX-CELL(Sigma-Aldrich C8862)

  • ISF-I (Biochrom F9061)

  • CD CHO (Gibco 10743-029)

  • CDM4CHO (HyClone SH30558.02)

  • CHO-III-A (Gibco 0970147DK)

  • Octomed (Biochrom F8085)

  • HybridoMed (Biochrom F8055/1)


培养基的主要特性如表 1 所示:


表 1. 7 种无血清培养基的主要特性



试验结果显示,培养基 Octomed 和 HybridoMed 这两种培养基随着比例的提高,细胞活率呈下降趋势,而在另外五种无血清培养基中 CHO-K1 的细胞活率没有明显的差异(图 4)。但是在 ISF-I 和 CD CHO 培养基中,细胞活率水平随时间增加呈现降低趋势,而 CDM4CHO 培养基维持稳定的 90% 活率水平,与之对比的 CD CHO 培养基仅能维持 50% 的活率。而对于细胞密度来说 CDM4CHO 培养基也与其他所有培养基(除 EX-CELL 外)都有明显的统计上显著差异(p<0.005)。




图 4. CHO-K1 细胞在五种培养基中的细胞活率和密度


对单抗产量和比产率这两项指标来说无血清培养基有相似的统计学结果(图 5)。CDM4CHO 和 EX-CELL 培养基表现出最高的单抗产量,同时随着时间增加产量水平亦有提高的趋势。最低比产率出现在 CDM4CHO 培养基,最高的比产率出现在 CHO-III-A 培养基中,其中原因可能是细胞密度水平的影响。




图 5.  在五种不同培养基中 CHO-K1 细胞的单抗体积产量和比产率




综合以上结果,CDM4CHO 培养基表现出最高水平的细胞密度和单抗产量,且随着培养时间增加会有提高的趋势。在延时培养的生物药工艺中这些特性提供了充分的应用的依据。


04

宿主细胞蛋白检测方法 


目前法规单位要求在生产过程中控制宿主细胞蛋白(HCP)的浓度,最终产品的宿主细胞蛋白需去除至可接受的量(<100ppm),显示如何准确检测 HCP 的浓度,是一个重要的课题。宿主细胞蛋白可以通过宿主细胞的主动分泌,也可以通过在收获和澄清细胞培养液时,细胞裂解/剪切而释放出来。而宿主细胞蛋白也会与下游纯化时使用的材料(例如塑料制品,填料等)的相互作用而残留,或者是与产物本身的相互作用而保留下来(图 6)。




图 6. 宿主细胞蛋白释放和相互作用


酶联免疫吸附测定法(ELISA)是常见用来检测全部宿主细胞蛋白浓度的方法之一,经由注射未带有表现蛋白的宿主细胞的 HCP 混合物于动物,并取得多克隆抗体检测 HCP,然而有些宿主细胞蛋白不会诱发免疫反应,或是引发微弱的免疫反应,都会使得多克隆抗体侦测不到这些宿主细胞蛋白。


此外,ELISA 通常只能得到全部宿主细胞蛋白浓度,但无法得知是何种 HCP 存在于产物中。尽管如此,ELISA 还是目前最主要用来检测宿主细胞蛋白的工具,并且有许多研究试着改善其限制,例如针对特定细胞系开发的 ELISA 试剂盒,以减少不同细胞系之间宿主细胞蛋白的差异。


如何评估 ELISA 抗体对宿主细胞蛋白的免疫反应效果(覆盖率)呢?2D-PAGE 是一个非常有用的工具,可检测在生产过程中产生的 HCP 组成,还可以做 ELISA 覆盖率的定量。在宿主细胞蛋白的检测过程中,低分子量蛋白的检测是最困难的,Amersham™ HCPQuant CHO 试剂盒旨在针对由 CHO-K1 细胞系产生的宿主细胞蛋白进行量化,不仅能够检测 LMW 范围酸性还可以检测碱性蛋白中的 HCP,借此提高试剂盒对于 HCP 的覆盖率。


Amersham™ HCPQuant CHO 试剂盒是利用具有荧光的 2D DIBE™ 技术,用 CyDye™DIGE Cy™3 预标记,然后使用 7 cm IPG 条带通过 2D 电泳法分离。将蛋白转移 到 PVDF 膜上,使用生物素化的抗 CHO 型 HCP 抗体进行探测。采用链霉菌素 Cy5 复合 物进行检测。将膜放置于 Amersham™ Typhoon 上进行扫描,并使用 Melanie™ 9 计算 覆盖率。


结果显示全部覆盖率为 95%,LMW 蛋白的覆盖率在 89% 至 93% 之间的范围内(图 7)。可以看出 Amersham™ HCPQuant CHO 含量测定分析增强了对宿主细胞蛋白的检测和定量,特别是对低分子量范围内的 CHO-HCP 蛋白具有较强的检测能力。


图 7.  象限分析情况(使用 2D DIBE 技术在 Amersham Typhoon (25 µm) 上进行扫描并用 Melanie 9 覆盖软件分析


另外还有利用非胶体方式检测宿主细胞蛋白的分析方法,如:LC-MS/MS, SELDI-TOF, FT-MIR,都可以用来分析和检测 HCP 的组成以及含量(图 8)。




图 8.  用于监测和测量 HCP 的分析技术


05

总结


细胞培养的性能会因不同培养基和补料策略而有影响,可在细胞株开发时使用和工艺开发及生产时相同的培养基,降低细胞适应不同培养基时引起的差异。利用 DoE 分析培养基的营养成分和配方,调整培养基成分,以提升细胞活率和产率。


生产工艺、补料策略、培养基的使用,都需经由实验、分析,以找到最佳适合细胞培养的条件。产品质量会因不同培养基、补料方式和细胞系不同而有差异,宿主细胞蛋白在终产品的含量需低于 100 ppm,属于关键产品指标,不同的检测方法有利有弊,需依据生产工艺的需求及法规单位的要求,选择合适的检测方法。