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细胞能量代谢整合研究方案深入揭示白果内脂保护心肌缺血的作用机制

来源:安捷伦科技 阅读数:146 时间:2020-12-17 13:35:51
心肌缺血(MI)是对人类健康造成重大威胁的常见病。在国内外,银杏叶提取物(Ginkgo biloba L. extract, GBE) 被广泛应用于防治缺血性心脏病。GBE 治疗心肌缺血作用靶点的发现及作用机制的揭示,可为后续 GBE 新药研发和临床应用提供重要的理论基础和科学依据,意义重大。
近期,中国医学科学院药物研究所张金兰研究员团队在 Journal of Pharmaceutical Analysis 发表论文[1],基于前期的代谢组学研究成果[2],实现了整合代谢流及 Seahorse 细胞分析对 GBE 治疗心肌缺血靶点及作用机制的深入阐释。
专家解读核心信息
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代谢组学,作为系统生物学应用实施的有利技术手段,已广泛应用于生命科学领域,为研究人员提供了大量代谢物和代谢通路信息,如何利用好代谢组学的研究结果,深入揭示生命科学问题、药物作用机制和特点成为目前研究的热点。
代谢流及 Seahorse 细胞分析可以为代谢组学的拓展研究提供重要手段:代谢组学能够发现潜在生物标记物及匹配相关作用通路,代谢流可以进一步揭示通路的动态活动,Seahorse 在活细胞水平进行药效筛选与功能的进一步验证,最终实现从生物标记物发现到机理机制的深入阐释。
研究整体策略
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  • ·代谢组学发现 GBE 心肌缺血保护作用的潜在生物标记物及匹配能量代谢作用通路

  • ·Seahorse 在活细胞水平从能量代谢角度筛选 GBE 起效的活性单体,同时阐明 GBE 调控能量相关代谢机制

  • ·利用稳定同位素示踪代谢流分析技术追踪活性单体通路调控的动态过程(流向和通量),最终实现对机理机制的深入阐释

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图 1. 基于质谱代谢组学、代谢流与 Seahorse 细胞能量代谢的整合方案
研究结果
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1. GBE 心肌缺血保护作用的代谢组学研究
采用安捷伦 6490 LC/QQQ 靶向代谢组学分析技术,发现 GBE 可以显著改善缺血引起的心肌脂质、氨基酸和能量代谢紊乱,尤其是显著减少心肌组织中由 TCA 循环障碍引起的柠檬酸累积,并减少MI后四种氨基酸代谢为 TCA 循环中间体。研究结果初步表明 GBE 能够调控 TCA 循环的代谢,调节中间代谢产物的代谢平衡。
2. Seahorse 筛选 GBE 调控能量代谢的活性单体和机制研究
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图 2. 基于组学结果的 Seahorse 与代谢流验证工作流程
Seahorse 技术是一种活细胞能量代谢实时监测技术,可以提供活细胞在正常和病理状态下的能量代谢表型,验证代谢位点和途径。Seahorse 实验结果显示异丙肾上腺素(ISO)诱导的缺血样心肌细胞显著降低了基础呼吸值、ATP产生量和最大呼吸值。
通过对 GBE 不同单体的缺血样心肌细胞能量代谢实时监测,表明 GBE 重要活性单体白果内酯能够提高缺血样心肌细胞的基础呼吸值和 ATP 产生量,能够显著提高损伤细胞的最大呼吸值。
综合上述实验数据发现,白果内酯对缺血样心肌细胞有明显的线粒体呼吸保护作用。Seahorse 的研究结果验证了代谢组学的发现:GBE 及单体化合物能够调节TCA代谢。
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图 3. 经 ISO 和白果内酯处理的 H9c2 细胞的线粒体呼吸活性
3. 代谢流揭示白果内酯调控 TCA 通路的动态过程
基于代谢组学和 Seahorse 能量代谢研究锁定的 TCA 通路及 Seahorse 筛选的 GBE 的重要活性单体白果内酯,进一步采用安捷伦 6550 LC/Q-TOF 系统及 VistaFlux 代谢流分析软件,对白果内酯调控 TCA 通路的动态活动进行了深入研究。
以 [U-13C] 葡萄糖为示踪剂,首先研究 ISO 损伤后 H9c2 心肌细胞的能量代谢紊乱。研究结果表明,损伤细胞 TCA 循环上游代谢物的 13C 标记比例显著增加,而下游代谢物的13C 标记比例显著降低,表明心肌细胞损伤后,碳源葡萄糖代谢进入 TCA 循环增加,但在异柠檬酸和 α-酮戊二酸之间受阻。
与模型组相比,白果内酯处理后的损伤细胞表现出如下变化:TCA 循环上游代谢物的 13C 标记比例显著降低,下游代谢物的 13C 标记比例显著增加,表明白果内酯能够促进累积的柠檬酸/异柠檬酸和顺式乌头酸进入下游通路,从而调节了 TCA 循环的代谢流。
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图 4. [U-13C] 葡萄糖代谢示意图
4. 白果内酯保护缺血心肌细胞能量代谢的机制
基于代谢组学、代谢流整合 Seahorse 的研究结果,同时结合酶活性实验,最终可以揭示白果内酯保护心肌缺血的作用机制:
ISO损伤缺血样心肌细胞中碳源葡萄糖从糖酵解到 TCA 循环的代谢流受阻,其它碳源进入 TCA 循环增强。GBE 中的单体白果内酯能够有效调节损伤心肌细胞的线粒体有氧呼吸,它通过降低受损细胞中关键代谢酶的表达,显著调节 TCA 循环代谢流,减少了上游代谢物的异常积累,平衡了 TCA 循环对不同碳源的需求。
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   图 5. 白果内酯保护缺血心肌细胞能量代谢的机制
研究结论

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基于本研究结果,揭示了 GBE 保护心肌缺血的物质基础、作用靶点,明确了白果内酯是 GBE 重要的活性化合物之一,进一步证明了心肌缺血的病理代谢机制。本研究成果无疑将为新药的发现提供重要启发,也显示出代谢流和 Seahorse 技术结合能够拓展和延伸代谢组学的研究结果,为中草药作用机制研究提供有力的研究策略。
参考文献
1.Z. Wang, F. Zhang, W. Liu, N. Sheng, H. Sun, J. Zhang, Impaired tricarboxylic acid cycle flux and mitochondrial aerobic respiration during isoproterenol induced myocardial ischemia is rescued by bilobalide, Journal of Pharmaceutical Analysis, https://doi.org/10.1016/j.jpha.2020.08.008.
2.Zhe Wang , Jinlan Zhang, Tiankun Ren , Zhen Dong. Targeted metabolomic profiling of cardioprotective effect of Ginkgo biloba L. extract on myocardial ischemia in rats. Phytomedicine 23 (2016) 621–631