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对硫磷纳米抗体筛选及分子识别机制研究
张玉琪 , 张瑾如 , 王锋 , 李家冬 , 司睿 , 吕丽珊 , 沈玉栋 , 王弘 , HAMMOCK Bruce D , 孙远明
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.181772
对硫磷是一种广谱的有机磷酸酯类杀虫、杀螨剂,毒性极强,可对环境和人类健康造成严重危害。尽管我国已禁止使用对硫磷,但仍存在违禁使用现象,加强对其监测十分必要。纳米抗体是已知最小的与抗原结合的片段(15 kDa),来源于骆驼科动物体内重链抗体的可变区,具有稳定性强、灵敏度高、易表达、水溶性好等特性。本研究基于噬菌体展示技术构建了抗对硫磷纳米抗体库,其库容为2.41×107 cfu/mL,经抗原-抗体固相亲和筛选及噬菌体酶联免疫法(Phage ELISA)鉴定,获得5种抗对硫磷纳米抗体VHH1、VHH6、VHH13、VHH21和VHH24。以结合能力最强的VHH1为基础,采用同源建模和分子对接技术探讨VHH1与对硫磷分子的识别机制,发现VHH1与对硫磷存在氢键和疏水间分子作用力,关键氨基酸是Ser60、Lys104、Phe105、Gly106和Arg107。本研究为抗体的进化改造和半抗原的设计提供了新思路。
关键词: 纳米抗体, 对硫磷, 噬菌体展示, 分子模拟
牛奶及水样中泰乐菌素酶联免疫检测方法研究
姚婵媛 , 杨金易 , 徐振林 , 王弘 , 雷红涛 , 孙远明 , 田元新 , 沈玉栋
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181057
针对环境及食品中泰乐菌素残留问题,本研究将泰乐菌素分子结构侧链醛基一步直接氧化为羧基,并将其作为新的半抗原,通过免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗泰勒菌素多克隆抗体,优化的反应条件为:包被原稀释6000倍,抗体稀释2000倍,反应缓冲液为pH 7.4、吐温含量0.1%、离子浓度0.01 mol/L的PBST,二抗稀释倍数为4000倍,二抗反应时间30 min。在此优化条件下,建立了检测泰乐菌素的间接竞争酶联免疫分析法(icELISA),半数抑制浓度(IC50)为1.39 ng/mL,线性范围(IC20~IC80)为0.17~11.0 ng/mL,检出限(IC10)为0.07 ng/mL,与结构功能类似物交叉反应率均小于0.1%。对纯牛奶、自来水、鱼塘水中泰乐菌素的添加回收率在78.4%~105.6%之间,RSD < 15%,检测结果与HPLC-MS/MS方法具有良好的相关性(R2=0.97)。本研究建立的icELISA方法适用于牛奶及水样中泰乐菌素残留的特异性快速筛查。
关键词: 间接竞争酶联免疫吸附分析, 泰乐菌素, 牛奶, 水样
酶联免疫法检测动物组织及尿液中氟苯尼考与甲砜霉素的残留
李然 , 林泽佳 , 杨金易 , 徐振林 , 王弘 , 雷红涛 , 孙远明 , 沈玉栋
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181084
针对食品中氟苯尼考及甲砜霉素多残留污染问题,基于新设计的半抗原制备了系列人工抗原,通过免疫动物获得了可同时特异性识别氟苯尼考与甲砜霉素的多克隆抗体,并在抗体-包被原组合的筛选及反应条件优化基础上,建立了动物组织及尿液中氟苯尼考和甲砜霉素残留同时检测的酶联免疫分析方法。本方法对于氟苯尼考的半数抑制浓度(IC50)为1.32 ng/mL,线性检测范围为0.31~5.61 ng/mL,检出限为0.12 ng/mL;对于甲砜霉素的IC50为2.13 ng/mL,线性检测范围为0.41~11.20 ng/mL,检出限为0.15 ng/mL,与氯霉素等多种类似物均无交叉反应,动物组织及尿样中氟苯尼考和甲砜霉素的添加回收率均在77.2%~116.0%之间,相对标准偏差 < 15%,适用于实际样品中氟苯尼考和甲砜霉素的快速筛查检测。
关键词: 氟苯尼考, 甲砜霉素, 抗体, 间接竞争酶联免疫吸附分析
保健酒与口服液中他达拉非类药物微孔侧流免疫层析检测方法研究
邹婷婷 , 杨金易 , 徐振林 , 王弘 , 孙远明 , 雷红涛 , 谭学才 , 沈玉栋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191208
采用共有骨架结构结合不饱和线性手臂半抗原策略,通过免疫新西兰大白兔获得了可同时识别他达拉非、氨基他达拉非和去甲基他达拉非的特异性多克隆抗体,通过优化反应条件,建立了微孔侧流免疫层析方法,用于保健酒及口服液样品中非法添加的他达拉非类药物残留的快速检测。本方法定量检出限为0.05~0.30 ng/mL,裸眼消线值在50~100 ng/mL之间,检测时间小于10 min;与其它结构功能类似物无明显交叉反应,特异性良好。对保健酒及口服液样品的添加回收率在78.7%~117.8%之间,相对标准偏差小于15%。本方法检测结果与HPLC-MS/MS法检测结果一致,适用于保健酒及口服液中他达拉非类药物的快速筛查。
关键词: 他达拉非, 微孔侧流免疫层析, 保健酒及口服液, 半抗原, 多克隆抗体