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毛细管电泳法研究核酸库容量对蛋白质适配体筛选的影响
李林森 , 朱超 , 赵毅 , 杨歌 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191693
毛细管电泳(CE)具有高分辨、快速分离、样品用量小和无需固相介质等优点,是高效筛选核酸适配体的方法之一。然而,由于CE的进样量少,有限的核酸库容量是否影响毛细管电泳-指数富集配体系统进化(CE-SELEX)适配体的筛选效率,尚不明确。本研究以神经元特异性烯醇化酶(NSE)为模式蛋白,考察了CE筛选中核酸库容量对筛选效率的影响,以明确CE-SELEX方法的有效性。分别使用4个浓度(0.1、1、10和100 μmol/L)的初始核酸库进行适配体筛选,比较了初始库与经3轮筛选后的次级核酸库的亲和力。结果表明,4个核酸库筛选轮次间库亲和力相近,且经2轮筛选后均得到了微摩尔级别的核酸适配体。此外,用高浓度核酸库筛选获得的序列更具多样性,但未能提升候选序列亲和力。经2轮筛选得到NSE的核酸适配体Seq qN-01,其与NSE复合物的解离常数(KD)为(4.72±0.15) μmol/L,并表现出很好的特异性。综上,核酸库容量会提高后续富集库的序列多样性,但对适配体筛选效率没有显著影响。
关键词: 神经元特异性烯醇化酶, 核酸库容量, 核酸适配体筛选, 毛细管电泳-指数富集配体系统进化
毛细管电泳法筛选脱铁转铁蛋白的核酸适配体及筛选影响因素分析
杨歌 , 赵毅 , 韩诗邈 , 朱超 , 黄渊余 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191694
核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,在体外筛选获得的与目标分子有高亲和力与特异性的寡核苷酸序列。由于筛选过程周期长且影响因素复杂,使用常规筛选方法进行多因素影响的条件优化的工作量大,样品消耗多,目前还少有系统的研究报道。毛细管电泳(CE)具有高分辨率、快速分离、样品用量小、筛选成本低的优势,是核酸适配体筛选的有效方法。本研究以人血清中脱铁转铁蛋白(A-TF)为模式蛋白,利用CE方法研究核酸库长度、孵育温度、缓冲溶液的种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸库相互作用的影响。结果表明,较短序列的核酸库与靶蛋白的亲和力更高;孵育温度、缓冲液种类与pH值均影响靶蛋白与核酸复合物的形成;低浓度的K、Ca2+与Mg2+可促进复合物形成。基于优化的筛选条件,经过3轮毛细管电泳法筛选,获得了A-TF的适配体Seq A3,采用CE-LIF测得复合物的亲和常数KD=0.476 μmol/L。此适配体可用于人血清基质中A-TF的识别。
关键词: 脱铁转铁蛋白, 核酸适配体筛选, 影响因素, 毛细管电泳, 指数富集配体系统进化
乳腺癌生物标志物钙网蛋白的核酸适配体筛选及血清检测和乳腺癌细胞识别
孙淼 , 杨歌 , 赵毅 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201004
钙网蛋白(CRT)与许多癌症的发生密切相关,被认为是乳腺癌侵袭和转移的有效新型生物标志物以及乳腺癌分期和预后的评价指标。本研究利用毛细管电泳-指数富集配体进化技术(CE-SELEX)筛选并鉴定了CRT的核酸适配体。毛细管电泳法、等温滴定量热法及纳米金比色法表征结果表明,适配体Apt 23对CRT具有较高的亲和力和特异性。FAM标记的Apt 23(FAM-Apt 23)可用作毛细管电泳的亲和探针,采用激光诱导荧光检测器,检测血清中CRT的浓度范围为1~1000 nmol/L,检出限为0.5 nmol/L。FAM-Apt 23也可用作CRT的免疫荧光成像探针,可结合在CRT过表达的乳腺癌细胞4T1的表面。初步研究结果表明,利用毛细管电泳筛选的核酸适配体Apt 23可用于CRT识别和检测的探针。
关键词: 钙网蛋白, 核酸适配体, 毛细管电泳-指数富集配体系统进化