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毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究
杨歌 , 朱超 , 刘晓慧 , 王勇 , 屈锋
doi:  10.11895/j.issn.0253-3820.181347
毛细管电泳(CE)被认为是核酸适配体筛选的高效方法,其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离高效,样品用量少,筛选成本低。但由于小分子靶与核酸的结合位点少,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,通常认为CE-SELEX不适用于筛选小分子靶标的适配体。本研究建立了基于CE-SELEX的盐酸克伦特罗靶标的的适配体筛选方法。将80 nt的ssDNA库与盐酸克伦特罗特混合孵育,通过CZE-UV分离混合物。收集ssDNA库峰前的馏分,通过PCR扩增和ssDNA制备,完成第一轮筛选。将次级核酸库经过3轮筛选,获得10条ssDNA序列。选择3条亲和力较强的序列Apt 4、Apt 7、Apt 12,通过CE-LIF测定其与盐酸克伦特罗的Kd分别为9.315×10-7 mol/L、1.040×10-6 mol/L和1.143×10-5 mol/L。软件分析表明,上述3条序列均可形成茎环二级结构,其中Apt 4茎环结构的自由能最低,结构最稳定。以沙丁胺醇为对照,验证了3条序列,具有较高的特异性。
关键词: 盐酸克伦特罗, 核酸适配体筛选, 毛细管电泳, 毛细管电泳-指数富集配体系统进化
蛋白质的核酸适配体筛选及应用的研究进展
赵丽萍 , 杨歌 , 张小敏 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201024
核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)筛选方法获得的,能够与靶标分子高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA。蛋白质是一种非常重要的生物功能大分子,迄今为止,已经开发了许多SELEX技术,用于蛋白质的适配体的筛选。目前,适配体的筛选优化方法主要集中在提高筛选效率、降低筛选成本,以及提升适配体性能等方面,从而获得可与靶标分子以高亲和力和高特异性结合的适配体。适配体与靶标分子亲和力的表征是关键的筛选步骤,用于判定所筛选的适配体是否可以满足后续应用需求。本文归纳总结了2016年以来蛋白质靶标的适配体筛选的研究进展,对核酸适配体筛选过程中有关核酸库的优化方法和筛选方法的改进、新筛选方法的开发、核酸适配体的应用等方面的研究进行了评述。
关键词: 核酸适配体, 蛋白质, 筛选, 指数富集配体系统进化, 评述
小分子靶标的核酸适配体筛选研究进展
王子健 , 陈尔凝 , 杨歌 , 赵新颖 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201101
核酸适配体(Aptamer)作为新型识别分子,在小分子传感分析和检测中有很大的应用潜力。小分子的Aptamer筛选是其应用的前提。本文综述了2015~2019年,有关毒素、抗生素、激素等近80种小分子的Aptamer的筛选研究进展,归纳总结了近百条Aptamer序列和平衡解离常数KD及其测定方法,简要介绍了基于氧化石墨烯、人类基因组、石英晶体微天平以及计算机辅助筛选等改进型指数富集配体系统进化技术。
关键词: 核酸适配体, 小分子, 指数富集配体系统进化技术, 综述
毛细管电泳与核酸适配体高效筛选
朱超 , 赵新颖 , 杨歌 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201173
指数富集配体系统进化(SELEX)技术是核酸适配体筛选的通用技术,精准高效的筛选方法和筛选策略设计是成功筛选适配体的关键。本文概述了本课题组自2007年以来,应用毛细管电泳(CE)技术研究核酸适配体高效筛选的有关工作,包括CE在核酸适配体筛选前、筛选中及筛选后各环节中的分析分离应用、不同蛋白靶的分类及筛选策略、多种CE筛选模式和多尺度靶标的核酸适配体筛选。同时,探讨了SELEX中存在的问题,并对其发展前景进行了展望。
关键词: 毛细管电泳, 核酸适配体筛选策略, 多模式筛选, 多尺度靶标, 评述
毛细管电泳法筛选人IgG的Fc片段核酸适配体
杨歌 , 韩诗邈 , 赵丽萍 , 朱超 , 黄渊余 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191761
基于毛细管电泳-指数富集配体系统进化技术(CE-SELEX)建立了免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段的核酸适配体筛选方法。通过毛细管区带电泳方法分析IgG完整蛋白、Fc与Fab片段的样品的纯度、荷电性质及是否吸附的特征,并比较三者与核酸库的亲和力。结果表明,IgG与核酸库形成明显的复合物,而Fc和Fab片段与核酸库的亲和力很弱。在筛选Fc片段的适配体时,选择Fab片段作为反筛靶,对去除非特异性结合序列无显著作用。设计了针对Fc片段的适配体筛选方案,在优化的孵育条件(10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4 (pH 7.17),0.05 mmol/L Mg2+,37℃孵育25 min)下,经3轮筛选获得Fc片段的核酸适配体Seq Fc1-3,KD值为0.071-0.321 μmol/L,经胶体金比色分析方法验证了其亲和力与特异性。
关键词: 免疫球蛋白, 免疫球蛋白G Fc片段, 核酸适配体筛选, 毛细管电泳, 毛细管电泳-指数富集配体系统进化
毛细管电泳法研究核酸库容量对蛋白质适配体筛选的影响
李林森 , 朱超 , 赵毅 , 杨歌 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191693
毛细管电泳(CE)具有高分辨、快速分离、样品用量小和无需固相介质等优点,是高效筛选核酸适配体的方法之一。然而,由于CE的进样量少,有限的核酸库容量是否影响毛细管电泳-指数富集配体系统进化(CE-SELEX)适配体的筛选效率,尚不明确。本研究以神经元特异性烯醇化酶(NSE)为模式蛋白,考察了CE筛选中核酸库容量对筛选效率的影响,以明确CE-SELEX方法的有效性。分别使用4个浓度(0.1、1、10和100 μmol/L)的初始核酸库进行适配体筛选,比较了初始库与经3轮筛选后的次级核酸库的亲和力。结果表明,4个核酸库筛选轮次间库亲和力相近,且经2轮筛选后均得到了微摩尔级别的核酸适配体。此外,用高浓度核酸库筛选获得的序列更具多样性,但未能提升候选序列亲和力。经2轮筛选得到NSE的核酸适配体Seq qN-01,其与NSE复合物的解离常数(KD)为(4.72±0.15) μmol/L,并表现出很好的特异性。综上,核酸库容量会提高后续富集库的序列多样性,但对适配体筛选效率没有显著影响。
关键词: 神经元特异性烯醇化酶, 核酸库容量, 核酸适配体筛选, 毛细管电泳-指数富集配体系统进化
毛细管电泳法筛选脱铁转铁蛋白的核酸适配体及筛选影响因素分析
杨歌 , 赵毅 , 韩诗邈 , 朱超 , 黄渊余 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.191694
核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,在体外筛选获得的与目标分子有高亲和力与特异性的寡核苷酸序列。由于筛选过程周期长且影响因素复杂,使用常规筛选方法进行多因素影响的条件优化的工作量大,样品消耗多,目前还少有系统的研究报道。毛细管电泳(CE)具有高分辨率、快速分离、样品用量小、筛选成本低的优势,是核酸适配体筛选的有效方法。本研究以人血清中脱铁转铁蛋白(A-TF)为模式蛋白,利用CE方法研究核酸库长度、孵育温度、缓冲溶液的种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸库相互作用的影响。结果表明,较短序列的核酸库与靶蛋白的亲和力更高;孵育温度、缓冲液种类与pH值均影响靶蛋白与核酸复合物的形成;低浓度的K、Ca2+与Mg2+可促进复合物形成。基于优化的筛选条件,经过3轮毛细管电泳法筛选,获得了A-TF的适配体Seq A3,采用CE-LIF测得复合物的亲和常数KD=0.476 μmol/L。此适配体可用于人血清基质中A-TF的识别。
关键词: 脱铁转铁蛋白, 核酸适配体筛选, 影响因素, 毛细管电泳, 指数富集配体系统进化
乳腺癌生物标志物钙网蛋白的核酸适配体筛选及血清检测和乳腺癌细胞识别
孙淼 , 杨歌 , 赵毅 , 屈锋
doi:  10.19756/j.issn.0253-3820.201004
钙网蛋白(CRT)与许多癌症的发生密切相关,被认为是乳腺癌侵袭和转移的有效新型生物标志物以及乳腺癌分期和预后的评价指标。本研究利用毛细管电泳-指数富集配体进化技术(CE-SELEX)筛选并鉴定了CRT的核酸适配体。毛细管电泳法、等温滴定量热法及纳米金比色法表征结果表明,适配体Apt 23对CRT具有较高的亲和力和特异性。FAM标记的Apt 23(FAM-Apt 23)可用作毛细管电泳的亲和探针,采用激光诱导荧光检测器,检测血清中CRT的浓度范围为1~1000 nmol/L,检出限为0.5 nmol/L。FAM-Apt 23也可用作CRT的免疫荧光成像探针,可结合在CRT过表达的乳腺癌细胞4T1的表面。初步研究结果表明,利用毛细管电泳筛选的核酸适配体Apt 23可用于CRT识别和检测的探针。
关键词: 钙网蛋白, 核酸适配体, 毛细管电泳-指数富集配体系统进化